(波士頓)自20世紀50年代以來，研究人員一直使用華萊士·庫爾特發明的著名方法“流式細胞術”來表征研究和人類個體血液樣本中不同類型的免疫細胞。這使得人們對免疫細胞的發育有了更深入的了解，也為評估人類健康和診斷各種血癌提供了新的方法。后來，流式細胞術也應用于其他細胞類型。

在傳統的流式細胞術中，用與熒光探針相連的抗體分子檢測細胞表面和細胞內蛋白質。然而，在提供單細胞靈敏度的同時，這種方法在檢測多種蛋白質時受到熒光團數量的限制，這些熒光團可以在整個熒光燈光譜中清楚地區分。2009年，“大規模細胞術”的出現，使人們能夠同時對單個細胞中的50種蛋白質進行定量分析，并對細胞的特性和生理狀態進行更細致的分析。在大規模細胞術中，抗體與金屬元素的非放射性同位素相關聯。這些同位素可以根據它們的質量在質量細胞儀的不同通道中進行量化。然而，與流式細胞術和熒光顯微鏡相比，質量細胞術及其同類“圖像質量細胞術”(IMC)用于在完整組織切片中可視化細胞蛋白，其代價是靈敏度降低。

現在，又過了15年，由哈佛大學Wyss研究所領導的一項研究合作，包括麻省理工學院和多倫多大學的研究人員，已經開發出一種利用DNA納米技術顯著提高細胞計數和IMC靈敏度的方法。將一種名為“循環延伸放大”(amplification by Cyclic Extension, ACE)的新型信號放大技術應用于與抗體相關的DNA條形碼，他們能夠將抗體結合金屬同位素產生的蛋白質信號放大500倍以上，并同時以高靈敏度檢測30多種不同的蛋白質。這種新方法使他們能夠定量檢測稀有蛋白質，研究復雜的生物組織變化，并研究調節免疫細胞功能的相互連接的蛋白質的整個網絡如何對刺激和病理條件作出反應。應用于IMC, ACE還可以在組織學切片上識別細胞類型和組織區室，以及與多囊腎病病理相關的組織變化。研究結果發表在《自然生物技術》雜志上。

“ACE有助于縮小細胞分析的關鍵差距:通過提高細胞計數的靈敏度，它使單細胞分析平臺同時實現高靈敏度、高復用和高吞吐量。它為研究懸浮液中的單細胞和完整組織提供了高度多路和敏感的方法，可以更深入地了解正常和病理生物過程，”領導這項研究的Wyss研究所核心教師彭銀博士說。Yin也是哈佛醫學院系統生物系的教授。

更多的DNA，更多的金屬同位素，更高的靈敏度

此前，Yin和他在Wyss研究所的團隊已經開發了多種dna成像技術，可以在單分子水平上以超高分辨率揭示細胞的內部運作，或者通過在單個組織切片中可視化許多不同的RNA和蛋白質分子。但是用這些方法產生的DNA結構沒有足夠的彈性來承受細胞計數術中使用的相對惡劣的條件。

“與傳統的大規模細胞術相比，ACE允許研究人員將抗體分子與大量增加的金屬同位素相關聯，從而解決了目前大規模細胞術的敏感性問題。這極大地促進了廣泛的低豐度蛋白質的量化，使用以前的單細胞方法一直具有挑戰性，”共同第一作者、尹氏小組的博士后倫曉康博士說。倫與共同第一作者盛寬偉博士合作完成了該項目，盛寬偉博士最初開發了ACE用于其他應用，包括多路復用成像，他也是尹的博士后研究員。盛說:“受到我們之前在引物延伸反應上的工作的啟發，該反應可以創建線性DNA串聯體(同一DNA序列的多個拷貝串聯在一起)，以及通過同步熱循環實現擴增的PCR反應，我們發明了ACE，通過可控的熱循環在原位合成線性串聯體。”

ACE為攜帶短金屬同位素的“檢測鏈”創建了一個具有多個結合位點的支架。此外，通過支架鏈的分支合成，研究人員可以進一步提高該方法檢測稀有蛋白質的靈敏度。線性ACE平均提供13倍的信號放大，而分支ACE允許最初未放大的信號增加500倍以上。為了穩定整個ACE序列復合物，并在質量細胞分析中保持其完整，他們用化學交聯劑將支架和添加的檢測鏈之間形成的短雙鏈交聯。“按照這個配方，我們設計了一個包含33個可區分的(同源)ACE序列的面板，這些序列的合成不會相互干擾，并將其應用于三種完全不同類型的分析，”Sheng說，他也是Yin團隊的博士后研究員。

工作中的ACE

研究小組首先利用ACE研究了上皮細胞向間充質細胞和再向上皮細胞的轉變。上皮-間充質轉化(EMTs)和間充質-上皮轉化(METs)發生在胚胎發育過程中，但當腫瘤發生侵襲性和轉移性時，前者也會重新發生。通過分析單個小鼠乳腺癌細胞在28天內從上皮細胞到間充質細胞再到間充質細胞的轉變過程中的32種上皮和間充質標記物、信號分子和罕見的轉錄因子，并對結果進行計算分析，他們能夠對這兩個過程有新的了解。“ACE使我們能夠同時分析低豐度轉錄因子水平與反映細胞生理和單細胞信號狀態的標記。這使得我們對EMT和MET中的分子程序是如何由關鍵轉錄因子(包括Zeb-1和Snail/Slug)的增加和減少所驅動的有了更詳細的了解。”

在他們的第二個例子中，他們放大到單個T細胞的內部工作。刺激其表面的t細胞受體(TCR)分子導致細胞內信號蛋白復雜網絡的激活。由于T細胞體積小，在單細胞分辨率上分析這些信號反應一直很困難。這個網絡中的單個蛋白質被磷酸殘基激活，磷酸殘基被其他通常稱為激酶的網絡蛋白質附著在它們上面。這些被激活的網絡蛋白中的許多繼續磷酸化網絡中的其他蛋白。這最終會導致t細胞行為的改變，例如對病原體或癌細胞的行為。研究人員將ACE應用于一組30種抗體，這些抗體與應激、炎癥、細胞增殖和其他反應中具有功能的tcr網絡蛋白中的磷酸化基元特異性結合。“使用ace增強的質量細胞分析，我們捕獲了個體原代人T細胞中動態變化的TCR網絡的定量快照。這使我們能夠研究特定t細胞激活事件的時間和持續時間的單細胞變化，并揭示細胞外信號如何從基態激活網絡”。

研究小組使用同樣的ace增強抗體小組來研究一種被稱為“損傷性t細胞麻痹”的現象。T細胞在其環境中受到損傷，例如在重大外科手術中引起的組織損傷，通常會產生免疫抑制。為了開始了解TCR網絡是如何導致這種情況的，Yin的小組與合著者Michael Yaffe醫學博士合作，Michael Yaffe是麻省理工學院David H. Koch科學教授和生物學和生物工程教授，他對組織損傷部位周圍的微環境如何抑制免疫系統有濃厚的興趣。Yaffe向研究小組提供了從接受手術的患者身上獲得的“術后引流液”(POF)樣本。用POFs和tcr刺激T細胞，使研究人員能夠分離出導致單個T細胞停止分裂并耗盡的不同網絡變化。

最后，他們研究了ACE在利用IMC對人體腎臟組織切片進行蛋白質空間分析方面的應用。由于腎臟組織本身具有很強的熒光性，因此熒光顯微鏡很難對其進行分析，而傳統的IMC則缺乏靈敏度。研究人員開發了一個由20種ace增強抗體組成的小組，用于各種腎臟標志物，并用它來檢查來自多囊腎病患者的腎皮質切片。他們與合著者、加拿大多倫多大學教授、多路成像專家Hartland Jackson博士合作采用了這種方法，使他們能夠識別腎臟近端和遠端小管、收集管和血液過濾腎小球內不同的細胞類型及其組織。倫說:“我們發現了細胞和組織組織的新的疾病特異性特征，并發現與腎臟疾病相關的干細胞標記物巢蛋白在腎小球中的表達非常不均勻。”“這可能意味著組織的不同部分可能同時經歷不同的病理階段。”

“彭銀的團隊和他們的合作者開發的這種新的細胞計數方法再次顯示了利用DNA納米技術來增強與臨床護理高度相關的現有技術的力量，并使其具有更高的靈敏度和特異性。“這種相對簡單的方法將導致對健康和疾病期間細胞，組織和器官功能的全新見解，”共同資深作者和Wyss創始董事Donald Ingber醫學博士說。


（文章來源：www.ebiotrade.com/newsf/2024-7/20240730235514992.htm）