一、數字PCR原理及優勢

數字 PCR（dPCR）是一種用于定量 DNA 或 RNA 靶標的基于PCR的新興技術。該方法建立在傳統PCR擴增和基于熒光探針的檢測方法的基礎上，以單分子分辨率實現對核酸分子的精確、絕對定量。

其樣本制備步驟與實時（RT）PCR 的步驟相似。將含有靶標序列、引物、探針和其他試劑的反應混合物隨機分配到成千上萬個通常具有相同體積的分區中，以使每個分區含有靶含 0、1或幾個靶標分子。使用熒光探針通過終點法來檢測擴增的靶標，以便從所有分區中分別獲得單獨的熒光亮度值。

圖1：分區和擴增后dPCR納米孔芯片的圖像。

在終點檢測時，包含擴增的熒光靶標分子的分區被視為陽性分區，而包含很少或沒有熒光且沒有任何擴增的靶標分子的分區被視為陰性分區。對于每次反應，陽性分區可能含有一個以上靶標分子，陰性分區的比例為使用泊松統計對包含靶擴增序列的分子數量進行定量提供了基礎。

與定量PCR（qPCR）相比，dPCR可實現更高的精密度、靈敏度和準確度，因為PCR抑制劑的干擾和競爭性背景DNA會因反應混合物的分區而減少。與 qPCR 相比，dPCR 的主要優勢包括：

• 無需標準曲線

dPCR定量更準確，因為它依賴于將分區聚類為陰性和陽性組，然后直接計數陰性分區并計算目標濃度，而無需運行標準曲線。這消除了擴增效率變化影響靶標定量的可能性。

•信噪比增加

相對于潛在PCR抑制劑和干擾背景序列，分區有效富集了靶標陽性分區中的靶標濃度，從而可以更靈敏地檢測罕見靶標。

圖2：通過分區顯示靶序列（橙色）富集相對于競爭性背景序列（藍色）的圖示。在未分區樣本中（左側試管），靶序列與背景序列的比例為 1:8。在靶標陽性分區（右邊的圓圈）中，比例從1:1至無窮大（純靶標）不等。

• 更高的精密度

分區還可以提高靶標定量的精密度。分區越多，精密度越高。合并多個泳道可以進一步提高精密度。

二、數字PCR儀分類

數字PCR儀按照其原理分為油包水液滴式和微孔芯片式，其中微孔芯片式技術較為先進。羅氏公司Digital LightCycler數字PCR儀是最新推出的高性能產品，充分拓展數字PCR的應用領域。

圖3.羅氏Digital LightCycler 數字PCR儀

羅氏Digital LightCycler優勢

1. 應用靈活：納米微孔芯片技術，3種密度芯片可更換，滿足不同應用場景；

2. 多重檢測：6重熒光多色檢測，便于開發更多的應用；

3. 高度自動化：分析系統整合PCR反應、芯片檢測功能，操作簡單；

4. 通量高：單次檢測8-96個樣本，兼顧靈活性與高通量；

5. 時間快：單塊板1.5h, 12塊板4h內完成樣品擴增、分析；

6. 5倍濃度預混液：可加入更大的樣品量，提交檢測靈敏度；

三、多病原檢測應用

大多數dPCR用戶仍然使用具有兩個光學通道的平臺，并依賴于復雜的方法（例如，滴定和混合不同標記的探針）進行多重檢測。這些方法需要大量的檢測設計專業知識、耗時的優化過程、由經驗豐富的用戶手動聚類，并且有時會生成難以解讀的結果。羅氏Digital LightCycler數字PCR儀的6通道檢測系統，通過將每個靶標分配至其自己的光學通道，大大簡化了多重檢測。多重檢測的優點包括：在一次反應中可檢測多個目標靶標；可選通道檢測額外的質控品或參比品；可減少樣本體積要求。

下圖應用羅氏dRCR儀同時檢測禽流感H1、H3、H5、H7、H9亞型和通用型6個病原，各檢測通道間無干擾，定量結果準確性高。

表1：6重檢測的目標靶標的通道分配。

圖4.多重病原檢測散點圖

多重PCR技術一次擴增反應即可實現對多種病原體進行檢測，相較單重檢測而言成本顯著降低。羅氏dRCR采用終點熒光檢測和納米微孔分區技術，檢測結果不受擴增效率的影響，能準確定量和避免漏檢。