近日，清華大學藥學院儲凌課題組在《Journal of the American Chemical Society》發表了題為“Self-Renewable Tag for Photostable Fluorescence Imaging of Proteins”的文章，報道了一種用于蛋白質光穩定熒光成像的熒光自修復蛋白標簽（srTAG），該工作作為活細胞蛋白熒光標記方法的強有力補充，能夠極大助力細胞內蛋白質運輸分布等相關生物問題的研究。
研究背景
隨著蛋白質標記技術的發展，活細胞熒光成像已成為研究蛋白質功能和定位的常規工具。而小分子染料的興起和利用熒光團的位點特異性結合的自標記標簽的開發擴大了熒光成像工具箱。與廣泛采用的熒光蛋白相比，自我標記蛋白(如HaloTag、SNAP-Tag)提供了更靈活的染料光譜特性選擇、更高的亮度和光穩定性。然而，在熒光成像實驗中，光漂白在一定程度上限制了空間和時間分辨率以及成像持續時間。
為了實現細胞器的長時間、多色顯微成像，Schepartz和Toomre實驗室報告了一系列高密度環境敏感（HIDE）探針，能夠識別質膜、內質網（ER）、線粒體、高爾基體，并且比相同的熒光團連接到細胞器駐留時間長15-40倍。HIDE探針利用脂質膜的親脂性環境將羅丹明兩性離子/螺環平衡轉變為非熒光螺環形式，“隱藏”這一熒光團池以避免光漂白，從而實現長時間超分辨率成像。盡管HIDE探針在某些情況下有用，但它依賴于靶向小分子的細胞器，因此不能推廣用于標記感興趣的蛋白質（圖1）。最近，HaloTag7的可逆熒光標記被報道。這些可逆的HaloTags（即xHTLs和reHaloTag）在不同超分辨率顯微長時程成像實驗中表現出優異的光穩定性。因此，迫切需要發展一種用于長時間同時對多種蛋白質成像的互補方法。
研究過程與成果
清華大學藥學院儲凌課題組探索了HIDE探針的概念和可逆交換標記策略是否可以結合起來開發用于蛋白質長時間成像的自標記標簽。AP1867是Ariad Pharmaceuticals開發的一種小分子，它能選擇性的與野生型FKBP12上的 FK506結合蛋白（FKBP）F36V突變體結合。在本工作中通過將熒光染料JF635與AP1867偶聯來合成ZCD-1，并在瞬時表達FKBPF36V-mEmerald NLS的U2OS細胞進行FRAP實驗，結果發現熒光信號能夠恢復到初始熒光強度的65%。在初步結果的鼓舞下，又通過評估不同彈頭、不同連接體、不同氨基酸突變對共聚焦成像質量和熒光恢復來優化標簽, 發現了srTAG (self-renewable Tag) FKBPF36L/ZCD-1。
與目前常用的自標記標簽相比，srTAG表現出明顯的熒光恢復，并給與三次光漂白刺激后能夠恢復到原有激光強度的65%。為了驗證srTAG在標記細胞內蛋白質方面的廣泛適用性，在表達FKBPF36L與內質網（ER）標記蛋白Sec61β, 線粒體嵴膜蛋白COX8A、線粒體外膜蛋白TOMM20和溶酶體膜蛋白LAMP1融合的活U2OS細胞進行了共聚焦成像。所有成像的蛋白質都給出了預期的分布模式。
為了闡明srTAG在超分辨率成像中的作用，作者在表達Lifeact-FKBPF36L和融合Sec61 b的U2OS細胞中進行了活細胞STED成像，結果顯示srTAG能夠用于超分辨成像，并且能夠將分辨率從共聚焦的200nm左右提升到70nm左右。與HaloTag相比，srTAG在超分辨STED成像中表現出更好的光穩定性。除此之外，srTAG能夠與可逆標簽reHaloTag兼容進行雙色成像。
細胞核內的m6A識別蛋白YTHDC1會發生液-液相分離，在活細胞中以核點狀分布。作者將YTHDC1與不同的標簽融合，以檢查標簽大小是否會影響YTHDC1的分布。表達EGFP、FlAsH或FKBPF36L融合的YTHDC1的U2OS細胞表現為核點狀。然而，Halo-YTHDC1的熒光信號在整個細胞核中擴散。
在該項工作的最后，作者猜測熒光信號的恢復可能是由于熒光團在蛋白質上的“開/關”平衡或非共價探針的可交換性。為了闡明其機制，首先純化了重組FKBPF36L蛋白，并將FKBPF36L/ZCD-1復合物固定在蓋玻片上。FRAP實驗通過全內反射熒光（TIRF）顯微鏡進行監測。結果顯示在沒有自由擴散的ZCD-1的情況下觀察到熒光的恢復，證實熒光團“在蛋白質上”的平衡有助于熒光的恢復。作為對照，純化的Halo/JF635-CA復合物在光漂白后沒有恢復熒光信號。另一方面，為了研究探針交換是否也有助于FRAP現象，首先用ZCD-1孵育表達NLS-FKBPF36L的U2OS細胞，然后替換為含有ZCD-7的培養基。結果顯示在532nm通道中出現熒光信號和在633nm通道中信號減弱，表明ZCD-1探針被ZCD-7交換。
研究意義
該課題組開發了一種用于蛋白質光穩定熒光成像的熒光自修復蛋白標簽（srTAG）。利用了熒光兩性離子和非熒光螺環形式之間的“蛋白質上”熒光團平衡，以及非共價探針的可交換性。該工作發現srTAG在光漂白后自發恢復熒光信號，與具有相同熒光團的Halo和SNAP-tag綴合物相比，漂白半衰期延長2到6倍。除此之外，srTAG概念適用于不同吸收和發射光譜的熒光團。srTAG能夠與STED顯微成像兼容，可以與其他可交換標簽組合進行多色成像實驗。此外，與其他自標記標簽或熒光蛋白相比，srTAG的尺寸較?。?2kDa），對活細胞中的蛋白質運輸和分布影響相對較小。因此，這項工作作為可逆標記標簽的強有力補充，能夠極大助力研究細胞內蛋白質運輸分布等相關的生物應用。
該項工作得到了國家重點研發計劃（No.2021YFA0910900）、國家青年人才計劃和清華大學啟動基金的資助。清華大學生命科學院，北京市生物結構前沿研究中心的陳春來教授和清華大學IDG/麥戈文腦研究所，清華-北大生命科學聯合中心吝易教授在機制和應用方面提供了大量的幫助。
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