單細胞多組學測序技術是指對一個單細胞同時檢測多個組學層面（例如基因組、表觀基因組和轉錄組）的測序技術。這類技術可以更系統、全面地探索細胞異質性以及同一個細胞內的不同組學層面之間的互動關系，有利于更深入地解析復雜的生理、病理過程中細胞類型特異性的分子調控機制1, 2。2019年，Nature Methods雜志將單細胞多組學技術評為年度技術3。
DNA甲基化作為一種表觀遺傳標記，在生物發育和腫瘤發生等生物學過程中發揮著重要作用。自從1992年以來，亞硫酸氫鹽（bisulfite）測序一直是DNA甲基化測序的金標準4。2012年，Benjamin P. Berman和Peter A. Jones團隊基于亞硫酸氫鹽轉化，細胞內源DNA甲基化通常發生在CpG位點的特點，以及DNA甲基轉移酶M.CviPI具有對處于開放染色質區域的GpC位點進行特異性甲基化的特點，開發了能夠用來同時檢測基因組（拷貝數變異）、DNA甲基組、染色質狀態組的NOMe-seq技術1。在此基礎上，北大生物醫學前沿創新中心湯富酬課題組和其他課題組分別開發了scCOOL-seq5和scNMT-seq6等單細胞多組學測序技術，能夠在單個細胞內同時檢測基因組（拷貝數變異）、DNA甲基組、染色質狀態組以及轉錄組。
然而，目前人們對單個細胞內表觀基因組及其與轉錄組之間的互動關系的了解主要來自二代測序平臺（next generation sequencing, NGS），測序讀長通常為300bp。在生理或病理條件下，不同的表觀基因組層面（例如DNA甲基化與染色質狀態）之間常常在相對較長的基因組區域內相互作用7, 8。近年來，伴隨著測序技術的發展，基于Oxford Nanopore或PacBio SMRT的三代測序平臺（third generation sequencing, TGS，也稱為單分子測序平臺）均能進行高通量長讀長測序，為長片段DNA上的表觀遺傳修飾的研究帶來了新的機遇。2022年，Nature Methods雜志將長讀長測序技術評為年度技術9。
涉及亞硫酸氫鹽轉化處理的DNA甲基化測序方法（例如BS-seq）往往會導致DNA片段的斷裂和降解，因而無法獲得較長的DNA片段。2020年，Winston Timp團隊結合Nanopore測序平臺能夠直接檢測DNA分子上甲基化修飾的特點和NOMe-seq的測序原理，研究開發出了NanoNOMe這一大量細胞樣本（bulk sample）的多組學測序方法，可在較長的染色質區域同時分析內源性DNA甲基化以及染色質可及性10。該方法需要0.5—1μg基因組DNA作為起始材料，不適用于胚胎等珍貴樣品以及腫瘤等具有高度細胞異質性的樣品。人類單個二倍體細胞的基因組DNA僅有6pg左右，因此單細胞測序技術往往需要PCR擴增，而PCR擴增會導致擴增產物喪失DNA修飾信息?；谌鷾y序平臺的單細胞多組學測序技術仍然有待開發，與此同時，單細胞分辨率下不同層面表觀遺傳信息的長距離調控規律也有待進一步探索。
2023年9月12日，湯富酬課題組在Cell Research上發表了題為“scNanoCOOL-seq: a long-read single-cell sequencing method for multi-omics profiling within individual cells”的論文，首次報道了名為scNanoCOOL-seq的單細胞多組學測序技術。該技術整合了三代測序平臺（單分子測序平臺）和scCOOL-seq原理，能夠實現在一個單細胞中同時精準檢測基因組（拷貝數變異）、DNA甲基化組、染色質可及性以及轉錄組等多個組學層面的信息。
論文截圖
scNanoCOOL-seq技術主要采用亞硫酸氫鹽轉化和單接頭PCR擴增的策略，最終獲得長度約為900bp的基因組DNA擴增片段。如下圖所示，scNanoCOOL-seq技術的實驗流程主要包括：1）通過溫和的方式進行細胞裂解和體外M.CviPI酶加甲基化后，進行單細胞的核質分離；2）單細胞的細胞核部分經過亞硫酸氫鹽處理和類PBAT策略的單接頭擴增后用于Nanopore平臺的單分子測序；3）單細胞的細胞質部分用于scRNA-seq文庫構建（優化的STRT-seq）后進行轉錄組檢測（圖1）。利用K562和HFF1這兩個人類細胞系，該研究證實了scNanoCOOL-seq能夠精準檢測單個細胞的DNA甲基化組（圖2a, b）、染色質可及性（圖2a, c）以及基因組（拷貝數變異）（圖2d），其檢測準確性與基于二代測序平臺的scCOOL-seq技術相當，但是測序讀長從原來的300bp增加到900bp。
圖1. scNanoCOOL-seq技術的實驗流程圖
圖2. scNanoCOOL-seq技術的檢測性能
該研究在多個方面對scNanoCOOL-seq技術的應用進行了探索：
1. scNanoCOOL-seq能夠在單個細胞中以單分子分辨率精準檢測DNA甲基化以及染色質可及性等表觀遺傳特征
相對于scCOOL-seq，scNanoCOOL-seq在長讀長方面的優勢主要包括以下兩點：1）數據顯示，人類基因組中的CpG島（CpG island, CGI）的中位數長度為575bp?；诙鷾y序平臺的測序數據（通常雙端300bp）往往無法在單分子水平完全覆蓋整個CpG島。而作為重要的調控元件，從單分子水平完整檢測CpG島中的DNA甲基化修飾有利于更好地研究CpG島甲基化對基因表達的調控作用。該研究證實基于三代測序平臺的scNanoCOOL-seq能夠在每個單細胞中完整覆蓋數百個CpG島和基因啟動子區域，當單細胞數量增加至400個左右時被完整覆蓋的CpG島和基因啟動子數量增加至總數的90%左右（圖3a, b）；2）基于二代測序平臺的測序方法難以用于檢測基因組中的復雜結構變異（structural variations, SVs），如染色體易位等基因組區域的表觀遺傳修飾。該研究發現基于三代測序平臺的scNanoCOOL-seq可以在單分子分辨率準確檢測K562細胞中由于染色體易位導致的BCR-ABL1融合基因以及相應的野生型等位基因的DNA甲基化以及染色質可及性特征（圖3c）。另外，scNanoCOOL-seq也能精準檢測印記基因的印記調控區域的親本特異性DNA甲基化模式（圖3d）。
圖3. scNanoCOOL-seq以單分子分辨率檢測全長CpG島、基因啟動子、染色質易位事件的表觀遺傳特征及親本特異性DNA甲基化
2. scNanoCOOL-seq能夠精準檢測細胞中DNA甲基化動態變化以及染色質可及性的異質性
5-氮雜胞嘧啶（5-aza）是一種常見的去甲基化藥物。該研究以5-氮雜胞嘧啶處理K562細胞作為生物學模型探究scNanoCOOL-seq在檢測DNA甲基化和染色質可及性的動態變化和異質性上的能力（圖4a）。結果表明，與預期相符，在經過5-氮雜胞嘧啶連續5天處理的K562細胞中DNA甲基化水平持續下降，而在對照組K562細胞中DNA甲基化水平維持不變（圖4b, c）。不僅如此，在經過5-氮雜胞嘧啶處理后K562細胞的全基因組DNA甲基化呈現出異質性增加的趨勢（圖4d）。為研究K562細胞響應去甲基化藥物后基因表達模式的動態變化，該研究進行了擬時間分析和功能富集分析。結果顯示，K562細胞在響應5-氮雜胞嘧啶處理過程中，表達水平下調的基因主要富集在細胞器分裂、染色體分離、核糖體生物合成、rRNA代謝過程和rRNA加工等生物學過程，而表達水平上調的基因主要是與白細胞趨化、免疫細胞增殖和激活等相關的基因。
圖4. scNanoCOOL-seq檢測K562細胞響應去甲基化藥物后的動態變化和異質性
3. scNanoCOOL-seq能夠精準刻畫小鼠囊胚發育過程中表觀基因組中的細胞譜系特異性特征
哺乳動物在著床前發育過程中經歷了顯著且關鍵的表觀遺傳重編程和細胞命運決定11。第一次細胞命運決定時早期囊胚分化成多能性內細胞團（inner cell mass, ICM）和滋養外胚層（trophectoderm, TE）。第二次細胞命運決定發生時晚期囊胚階段的內細胞團細胞進一步分化為上胚層（epiblast,Epi）和原始內胚層（primitive endoderm,PrE）（圖5a）。已知在隨后的發育過程中，上胚層細胞將發育成整個胚胎，而原始內胚層和滋養外胚層細胞將發育成胚外組織11。盡管已經對哺乳動物的早期胚胎發育進行了廣泛的研究5, 11，仍然還沒有在單細胞水平和多組學層面解析囊胚發育過程中表觀基因組和轉錄組的動態變化以及其互動關系。
該研究利用scNanoCOOL-seq技術在單細胞分辨率下系統地描繪了小鼠囊胚期胚胎中表觀基因組多個組學層面的動態變化（圖5b）。該研究發現，1）在晚期囊胚（E4.5）中，原始內胚層細胞中基因體（gene body）區的DNA甲基化水平（22.8%）高于上胚層細胞（18.8%），而滋養外胚層細胞中基因體區域的DNA甲基化水平（15.1%）最低。在晚期囊胚中，滋養外胚層細胞基因體區域的平均染色質可及性水平高于上胚層和原始內胚層細胞（圖5b）。2）早期雌性（XX）囊胚的內細胞團和滋養外胚層細胞中尚未完成印記式的X染色體失活（imprinted X chromosome inactivation, iXCI，父源X染色體特異性失活），而晚期雌性囊胚的原始內胚層和滋養外胚層細胞都顯示出已經完成了印記式的X染色體失活。與原始內胚層和滋養外胚層細胞不同，晚期雌性囊胚的上胚層細胞中有部分父源X染色體已經重新激活，并為后續發育階段X染色體隨機失活（random X chromosome inactivation, rXCI）做好準備（圖5c）。3）與上胚層細胞相比，晚期囊胚中的滋養外胚層細胞的母源基因組DNA甲基化具有更強的鏈偏向性和更低的DNMT1表達量，說明在滋養外胚層細胞中發生了更強烈的DNA被動去甲基化（在DNA復制過程中，DNA新生鏈上沒有完全補上甲基化修飾）（圖5d）。
圖5.scNanoCOOL-seq檢測小鼠囊胚不同譜系的鑒定、表觀組動態變化、等位基因特異性轉錄組和鏈特異性的表觀基因組
綜上所述，基于單分子測序平臺的scNanoCOOL-seq技術能夠對一個單細胞同時進行基因組（拷貝數變異）、DNA甲基化組、染色質可及性以及轉錄組測序分析。利用長讀長測序的優勢，scNanoCOOL-seq可以檢測全長CpG島和基因啟動子區域的多重表觀遺傳特征以及不同組學層面間的互動關系。此外，scNanoCOOL-seq還可以在單分子分辨率檢測染色體易位等復雜基因組結構變異事件產生的表觀遺傳改變，同時也為在單個細胞中對等位基因特異性的表觀遺傳特征以及DNA鏈特異性的表觀遺傳特征的研究提供了強大的工具。
北京大學前沿交叉學科研究院博士生林建立、薛曉慧為該論文的并列第一作者。湯富酬為該論文的通訊作者。該研究項目得到了國家自然科學基金基礎科學中心項目、科技創新2030-“腦科學與類腦研究”重大項目的資助。
參考文獻：
1 Kelly TK, Liu Y, Lay FD, Liang G, Berman BP, Jones PA. Genome-wide mapping of nucleosome positioning and DNA methylation within individual DNA molecules. Genome research 2012; 22:2497-2506.
2 Pott S. Simultaneous measurement of chromatin accessibility, DNA methylation, and nucleosome phasing in single cells. Elife 2017; 6.
3 Method of the Year 2019: Single-cell multimodal omics. Nature methods 2020; 17:1-1.
4 Liu Y, Siejka-Zielinska P, Velikova G et al. Bisulfite-free direct detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at base resolution. Nat Biotechnol 2019; 37:424-429.
5 Guo F, Li L, Li J et al. Single-cell multi-omics sequencing of mouse early embryos and embryonic stem cells. Cell Res 2017; 27:967-988.
6 Clark SJ, Argelaguet R, Kapourani C-A et al. scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells. Nature communications 2018; 9:781.
7 Xu C, Corces VG. Nascent DNA methylome mapping reveals inheritance of hemimethylation at CTCF/cohesin sites. Science 2018; 359:1166-1170.
8 Bell AC, Felsenfeld G. Methylation of a CTCF-dependent boundary controls imprinted expression of the Igf2 gene. Nature 2000; 405:482-485.
9 Method of the Year 2022: long-read sequencing. Nature methods 2023; 20:1-1.
10 Lee I, Razaghi R, Gilpatrick T et al. Simultaneous profiling of chromatin accessibility and methylation on human cell lines with nanopore sequencing. Nature methods 2020; 17:1191-1199.
11 Wang Y, Yuan P, Yan Z et al. Single-cell multiomics sequencing reveals the functional regulatory landscape of early embryos. Nat Commun 2021; 12:1247.
（文章來源：www.ebiotrade.com/newsf/）
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