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                              數字PCR儀在動防系統的應用
                              [ 發布日期:2023-10-10 8:54:12    閱讀次數:264 ]
                               一、數字PCR技術簡述

                              數字PCR技術(digital polymerase chain reaction,dRCR)有別于實時熒光定量PCR技術(Real-time Quantitative PCR,qPCR)。dRCR是第三代PCR技術,無需標準曲線,即可對不同生物樣本類型中獲得的DNA/RNA進行更精確、更靈敏的絕對定量檢測。

                              dRCR的原理及流程比較簡單,以目前主流的納米微孔芯片式dRCR儀為例:

                              1.配液:加入引物、探針、模板、Master Mix、水配制PCR反應體系;

                              2.分區:將PCR反應體系加入納米微孔芯片,芯片通常有20000個以上的納米微孔,反應體系分配到各個納米微孔之中,形成獨立的反應單元;

                              3.擴增:隨機分配的目標DNA/RNA分子在每個納米微孔中進行單獨、平行的PCR反應;

                              4.檢測:擴增結束后檢測各個納米微孔的熒光信號;

                              5.計算:理論上,樣本充分稀釋時,每個納米微孔包含少于或等于一個拷貝的目標DNA/RNA分子。但實際上,部分納米微孔可能含有多個DNA/RNA分子,因此在計數陰性、陽性納米微孔后,需要應用泊松分布進行校正,才能得到目標DNA/RNA分子的拷貝數或濃度。




                              圖1 dRCR的實驗流程



                              圖2 dRCR的泊松分布校正


                              與第一、二代PCR技術相比,dRCR具有很多優勢:一是特異性、靈敏性均有顯著提高;二是在不依賴內參和標準曲線的前提下,可直接得到絕對量化指標;三是納米微孔反應單元相互獨立、封閉,避免了PCR抑制劑及不同核酸分子擴增產物間的相互干擾,極大的提高了檢測的準確度和可重復性。

                              二、dRCR在動物疫病防控中的應用

                              1.核酸標準品定量

                              核酸標準品是一種已知濃度和純度的核酸分子,可以用于核酸定量、質量控制和實驗標準化等方面,是分子生物學和生物技術研究中非常重要的實驗材料。使用分光光度法測量核酸標準品濃度,容易受到污染核酸或蛋白質和鹽的影響,核酸標準品為質粒時,儲備液的不均勻性或存在沒有靶序列插入的質粒,同樣影響標準品定量的準確性。

                              dPCR技術在核酸標準品定量方面的優勢在于其高精度和高可靠性。dPCR技術可以準確地計算目標序列的拷貝數,避免了實時熒光定量PCR技術中的測量誤差和擴增效率誤差。因此,dPCR技術可以提供非常精確的核酸標準品定量結果。

                              2.動物疫病檢測

                              dPCR技術在動物疫病檢測方面的有廣泛的應用前景,可以檢測各種動物疫病的病原體,例如禽流感、口蹄疫、豬瘟等,其優勢在于其高靈敏度、高特異性和高可靠性。dPCR技術可以檢測樣品中非常低濃度的病原核酸,靈敏度相對于qPCR通常高5-100倍,因此可以在早期發現病例,從而避免疾病的擴散和傳播。

                              圖3 qPCR梯度檢測:10拷貝以下樣本無法檢出


                              圖4 dPCR梯度檢測:有效檢出10拷貝以下樣本


                              3.動物疫病多重檢測

                              多重PCR技術一次擴增反應即可實現對多種病原體進行檢測,相較單重檢測而言成本顯著降低。但是仍然存在許多影響多重PCR擴增與檢測效果的因素,其中多個靶標擴增效率的一致性是最大的難題,檢測重數越多,效率一致性往往越低。dRCR采用終點熒光檢測和納米微孔分區技術,檢測結果不受擴增效率的影響,能準確定量和避免漏檢。

                              目前主流品牌的dRCR儀均有多個檢測通道,如羅氏診斷的Digital LightCycler數字PCR儀擁有6個檢測通道,可實現6重病原檢測。下圖應用羅氏dRCR儀同時檢測禽流感H5、H7、H9亞型和新城疫病毒4個病原,各檢測通道間無干擾,定量結果準確性高。

                              圖5 羅氏Digital LightCycler數字PCR儀多重檢測

                              4.抗原快速診斷產品的評價

                              來源不同廠家的抗原快檢試劑,靈敏度差異較大。dPCR可以絕對定量待測樣品中的病原核酸,從而精準的評價抗原檢測試劑的檢測限。

                              5.動物疫苗研發中的應用

                              dPCR可對重組腺病毒疫苗等活載體疫苗進行定量,作為生產過程中質量評價、活性滴定、雜質評估的有力工具。同時,dPCR可定量動物血液中微量的病毒,可作為疫苗免疫效果評價的有效工具。

                              6.動物源性成分檢測

                              世界各國每年都會有許多肉類摻假事件被曝光,包括將廉價肉摻入高價肉或添加非肉成分冒充肉及肉制品等。dPCR技術可直接對物種特異性DNA的拷貝數進行絕對定量,只需構建物種特異性DNA拷貝數與肉粉重量之間的關系曲線,即可對肉制品含量進行定量。

                              三、納米微孔芯片數字PCR儀新貴

                              Digital LightCycler數字PCR儀是羅氏最新推出的高性能產品,充分拓展數字PCR的應用領域。

                              圖6羅氏Digital LightCycler 數字PCR儀

                              羅氏Digital LightCycler亮點

                              1.應用靈活:陣列式納米芯片技術,3種密度芯片可更換;

                              2.多重檢測:6 重熒光多色檢測,便于開發更多的應用;

                              3.高度自動化:分析系統整合PCR反應、芯片檢測功能;

                              4.通量高單次檢測 8-96個樣本,適合科研及臨床檢測;

                              5.時間快:單塊板1.5h, 八塊板滿載則 4h 內完成樣品擴增、分析;

                              6.5x預混液: 更大的樣品量輸入;

                              四、結語

                              dPCR以明顯的技術優勢,已經廣泛應用于核酸檢測的方方面面。dRCR在病原微生物檢測,腫瘤液態活檢,遺傳生殖檢測,公共衛生檢測,環境微生物檢測,RNA表達檢測,NGS文庫定量,甲基化檢測等領域都發揮著越發重要的作用。通過建立完善的dPCR檢測流程,相信dPCR能讓蓬勃發展的分子診斷如虎添翼。


                               
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