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                              科學家在小鼠細胞中制造新冠病毒受體蛋白
                              [ 發布日期:2024-1-25 8:49:12    閱讀次數:27 ]

                              美國能源部布魯克海文國家實驗室和哥倫比亞大學的一組科學家展示了一種生產大量受體的方法,這種受體是導致COVID-19的病毒SARS-CoV-2在人體細胞表面結合的受體?,F在臭名昭著的病毒刺突蛋白與人類“ACE2”受體之間的結合是病毒感染的第一步。在小鼠細胞中制造功能性人類ACE2蛋白給科學家們提供了一種研究這些受體的新方法,并有可能將它們投入使用。此外,正如剛剛發表在《病毒學》(Virology)雜志上的一篇論文所描述的那樣,這種方法可以促進其他被證明難以通過其他方式產生的復雜蛋白質的研究。

                              布魯克海文大學的科學家們在疫情早期的最初目標是制造大量的人類ACE2,然后將這種蛋白質附著在納米顆粒上。然后可以測試ace2包被的納米顆粒作為抗病毒治療藥物和/或作為檢測病毒顆粒的傳感器。

                              布魯克海文實驗室病毒學家Paul Freimuth與布魯克海文實驗室功能納米材料中心(CFN)的科學家合作領導了這項研究,他說:“對于這些應用中的任何一種,你都需要大量的蛋白質,而且蛋白質必須具有完整的功能。”“但是制造像ACE2這樣的功能性膜蛋白特別具有挑戰性,因為蛋白質在細胞膜上定位的過程很復雜。”

                              一個原因是這些蛋白質在合成后和插入細胞膜之前以各種方式被修飾。特別是,添加到蛋白質中的碳水化合物分子在長蛋白質鏈如何折疊成最終的3D結構以及蛋白質如何在膜中發揮作用方面起著關鍵作用。

                              “碳水化合物約占ACE2蛋白質量的三分之一,”Freimuth說。

                              科學家用來人工合成蛋白質的最簡單的細胞,即細菌,缺乏附著這些碳水化合物附加物的酶。因此,布魯克海文的研究小組轉向了老鼠的細胞,作為哺乳動物,老鼠更像我們,因此能夠進行同樣的碳水化合物處理。眾所周知,小鼠細胞擅長拾取和表達“外來”基因。雖然小鼠細胞也會產生ACE2受體,但小鼠版本的這種蛋白質不會與SARS-CoV-2刺突結合。這意味著科學家們將有一個簡單的方法來觀察小鼠細胞是否產生人類ACE2蛋白——通過觀察刺突是否與細胞結合。

                              ACE2基因的發現和表達

                              為了增加小鼠細胞整合并正確讀取人類ACE2基因的機會,研究小組使用了完整的基因。人類和其他“高等生物”的基因除了編碼構成蛋白質的氨基酸的DNA序列外,還包含大量信息。這些額外的信息有助于調節細胞染色體內的基因結構和功能。

                              科學家們搜索了作為人類基因組計劃的一部分而生成的克隆DNA片段文庫,找到了包含完整ACE2基因的片段,并完成了其嵌入的調控信息。人類基因組計劃是美國能源部資助的一項努力,旨在繪制出人類所有基因的位置。然后,他們將小鼠細胞暴露在涂有這種DNA片段和另一種蛋白質基因的納米顆粒中,這種蛋白質使細胞對致命的抗生素具有抵抗力。

                              “在這種情況下,納米顆粒充當DNA遞送劑,被細胞吞噬,這樣DNA就有可能整合到小鼠細胞染色體中,”Freimuth說。“為了找到攜帶外源基因的細胞,我們將抗生素添加到細胞培養中。那些不能吸收和表達抗生素抗性基因的細胞死亡,而那些獲得抗生素抗性的細胞存活下來并生長成菌落。”

                              科學家們將其中大約50個菌落擴展到單個培養中,然后對它們進行測試,以確定有多少菌落也攜帶了人類ACE2基因并產生了人類受體蛋白。

                              檢測蛋白質產量

                              “大約70%的耐抗生素菌落在細胞表面表達人類ACE2蛋白,”Freimuth說。“進一步的分析表明,這些菌落平均含有28份人類ACE2基因。”

                              重要的是,小鼠細胞保留了“外源”ACE2基因拷貝,并在至少90代細胞中持續制造由這些基因編碼的人類ACE2蛋白。

                              細胞產生的人類ACE2蛋白水平通常與整合到小鼠基因組中的ACE2基因拷貝數成正比。一些克隆的小鼠細胞產生的ACE2是正常小鼠細胞的50倍。

                              科學家們使用了多種方法來測試小鼠制造的人類ACE2蛋白是否具有功能。其中包括證明含有COVID刺突蛋白的“假病毒”(即sars - cov -2的非致病性替代品)可以與受體結合并感染細胞。

                              “這些傳染性試驗表明,在這些小鼠細胞上表達的人類ACE2蛋白是完全有效的,”Freimuth說。

                              用途及影響

                              與此同時,來自CFN的共同作者Oleg Gang和Feiyue Teng探索了多種方法來制造富含人類ACE2的細胞外納米囊泡,以潛在地治療COVID-19。他們還在研究將ACE2蛋白放置在納米顆粒上,用于治療感染或快速檢測病毒。

                              “基于ace2的納米囊泡面臨的挑戰在于增強其對SARS-CoV-2的中和作用。我們還在尋找增強和利用ace2偶聯納米顆粒的結合敏感性和特異性的方法,使其對病毒診斷有用。這兩種方法都需要未來的優化努力,”Teng說,他是CFN的一名研究助理,廣泛研究了這項研究的生物學方面和潛在的基于納米科學的應用。

                              “我們很高興將納米材料制造的進步與生物分子方法相結合,以開發新的治療和傳感策略,”Gang說,他在哥倫比亞大學擔任聯合職位。“這項研究使我們能夠克服一些方法上的問題,因為納米材料和生物系統需要完全不同的表征方法。我們在這里學到的東西對我們下一步加強基于納米粒子的生物傳感很重要。”

                              除了使重組ACE2蛋白的應用成為可能之外,這項工作還展示了一種生產多種復雜蛋白的新方法。例如,介導無數生物和疾病過程的大量細胞表面受體,以及工業上重要的蛋白質,如單克隆抗體和酶。

                              Freimuth說:“我們的方法是使用完整的基因和小鼠細胞,這些細胞可以適應在巨大的懸浮培養中生長,就像用于培養細菌的液體肉湯培養一樣,可以促進這些蛋白質和其他重要蛋白質的大規模生產。”

                              這項研究得到了實驗室指導研究和開發基金的支持,并使用了布魯克海文國家實驗室功能納米材料中心(CFN)的資源。CFN是美國能源部科學辦公室的用戶設施,由科學辦公室(BES)支持。

                              布魯克海文國家實驗室是由美國能源部科學辦公室支持的??茖W辦公室是美國物理科學基礎研究的最大單一支持者,正在努力解決我們這個時代一些最緊迫的挑戰。欲了解更多信息,請訪問science.energy.gov


                              (文章來源:www.ebiotrade.com/newsf/2024-1

                               

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