標記和可視化蛋白質是研究細胞生物學的基本工具，可以用于監測蛋白質動態變化和解析細胞內復雜相互作用，從而理解特定感興趣蛋白質（protein of interest, POI）的細胞功能。熒光成像技術在活細胞中研究蛋白質定位、功能及互作方面發揮著巨大作用。目前，常用的標記方法都有一定的局限性，例如抗體染色不能應用與活細胞，而小分子化學探針又缺乏通用型。目前最常用的是基因融合（使用熒光蛋白、自標記酶或肽標簽），然而該方法通常需要過表達編碼POI的開放閱讀框架（ORF），可能對蛋白質的正常表達、折疊、定位和功能造成干擾。近年來，隨著基因編輯技術的方法，通過基因編輯原位敲入編碼熒光蛋白或特定標簽的基因提供了高度精確的內源蛋白質標記方法。然而基因編輯方法可能對細胞造成致命或不可逆的影響，導致可能引起錯誤結論的人為現象。此外，在POI的基因序列編碼的N-或C-末端附近進行標簽插入的可編輯PAM位點通常對許多蛋白質不可用，限制了基于基因編輯的蛋白質標記方法的實用性。因此，亟需開發一種真正靈活和普遍適用的方法來標記內源蛋白，以填補現有蛋白標記技術的空白。

2024年2月1日，北京大學藥學院天然藥物及仿生藥物全國重點實驗室劉濤團隊在Nature Chemical Biology雜志發表了題為Tracking endogenous proteins based on RNA editing-mediated genetic code expansion的研究論文。研究者基于RNA編輯介導的非經典氨基酸（ncAAs）蛋白質標記（RENAPT）方法，RNA編輯系統在不改變基因序列的同時，實現在目標蛋白mRNA水平引入終止密碼子，且不受PAM序列的限制。然后通過非經典氨基酸系統，將熒光ncAA或具有生物正交反應手柄的ncAA進行后續染料標記在活細胞中，僅使用最小的氨基酸側鏈標簽，實現特異性地標記多種內源蛋白質（圖1）。該研究擴展了內源蛋白標記方法，提供了一個廣泛適用的平臺，可以在活細胞中標記內源蛋白質，以研究其定位和功能。

圖1 RENAPT系統在活細胞中標記內源蛋白

研究內容

1 RENAPT系統用于標記內源蛋白

為了在活細胞水平實現內源蛋白的實時示蹤，作者首先驗證了RNA編輯系統實現C到U的編輯效率，然后通過肽段質譜，確認了ncAAs可以位點特異性的整合到目標蛋白中。然后選擇內源蛋白GRP94的不同位點進行了標記驗證（圖2）。

圖2 RENAPT系統蛋白標記驗證

直接觀察蛋白質定位可以為研究蛋白質功能和相互作用提供重要的信息，因此，作者使用了一組已知亞細胞定位的內源蛋白，利用RENAPT系統進行實時標記?？梢杂^察到目標內源性蛋白質（GRP94Q452UAG ATP5AQ439UAG和IGF2-RQ506UAG）與各自的亞細胞定位熒光探針呈強烈的共定位信號（圖3）。

圖3 RENAPT用于不同內源蛋白的亞細胞定位

2 RENAPT系統進行蛋白雙標記

雙標記系統在蛋白標記中的應用可以幫助研究人員更全面地理解蛋白質的功能、相互作用和定位。組蛋白H3.3a和H3.3b分別由H3f3a和H3f3b基因編碼，它們在氨基酸序列上完全相同，但堿基序列不同。利用RENAPT系統，可以區分這2個蛋白，并對其分別進行標記，如圖4a所示。通過使用雙標記系統，研究它們在細胞內的定位。隨后，作者們對溶酶體蛋白IGF2-RQ506UAG和線粒體蛋白ATP5AR330UGA進行了雙標記（圖4b）。

圖4 RENAPT雙標記系統。a. 雙標記histone H3.3a-mCherry 和 histone H3.3b-eGFP蛋白. b. 雙標記內源ATP5A 和 IGF2-R蛋白.

3 RENAPT系統用于超分辨成像

作者通過HIS-SIM超分辨成像系統對內源蛋白ATP5AQ439UAG、IGF2-RQ506UAG和GRP94Q452UAG進行超分辨成像（圖5），得到了與相應的亞細胞熒光探針光譜重疊高度的共定位結果，PCC系數值在0.77-0.97之間。證明RENAPT系統可以用于超分辨成像的研究，可以幫助我們更清晰地觀察和研究細胞器和亞細胞結構、更深入地理解細胞內蛋白質的結構和功能，并為生命科學研究提供更多的可能性。

圖5 利用RENAPT進行超分辨成像

4. RENAPT系統用于原代海馬細胞內源蛋白標記

利用RENAPT系統，實現對神經細胞內源蛋白的高分辨率、高靈敏度和長時間的動態成像。Nav1.6負責神經元動作電位的起始和傳導，并通過與ankG膜結構域相互作用而聚集在AIS遠端。與ankG和Nav1.6抗體染色的共定位分析表明，RENAPT可以有效地標記Nav1.6（圖6）。類似地， Cav2.1和NFL分別與對應的抗體和神經標記物微管相關蛋白2（MAP2）進行標記，研究共定位效果。這些結果證實，RENAPT可以成功地標記原代海馬細胞中的內源性蛋白，這將有助于今后對它們表達、定位、相互作用和功能進行研究。

圖6 RENAPT用于小鼠海馬細胞內源蛋白標記

該研究開發的RENAPT系統跨越了傳統的內源蛋白標記技術，直接在RNA水平實現對內源目標蛋白是實時示蹤標記，擴展了內源蛋白質標記的方法，為更清晰地觀察細胞結構和蛋白質分布提供了新的平臺。文章首次結合RNA編輯與非經典氨基酸整合技術應用于內源蛋白標記系統，并且可以應用于神經細胞中目標蛋白的標記，期待未來科學家能夠進一步拓展該系統在其他方面的應用。

北京大學博士后郝敏，博士生凌鑫宇和講師孫懿為本文的共同第一作者。團隊成員王雪，常麗穎，曾志英，牛夢曉，天然藥物及仿生藥物全國重點實驗室儀器平臺指導老師李文哲、師曉萌、姜竺君和張曉輝也為本研究做出了重要貢獻。北京大學陳良怡教授為本研究做出了重要技術支持。通訊作者為北京大學藥學院劉濤研究員。該研究獲得中國國家重點研發計劃、國家自然科學基金、國家科技重大專項計劃、中國博士后科學基金和北京市自然科學基金等項目的支持。

文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41589-023-01533-w


（文章來源：www.ebiotrade.com/newsf/2024-2）