染色體分離、細胞分裂以及細胞增殖的其他過程是癌癥、衰老等多個研究領域的核心。細胞周期是高度協調并嚴格受控的，在單細胞水平具有適應性和異質性(1)。因此，計算工具將有助于此類研究，比如細胞周期的轉錄組動態研究(2)。

Bio-Rad公司流式細胞術應用科學家Sharon Sanderson解釋說：“細胞周期分析領域正通過技術和方案的不斷創新而向前發展。單細胞測序和高通量成像技術正幫助我們認識細胞周期及其與生物過程和疾病的相關性，但長期的細胞增殖研究需要無毒性方法。”

細胞周期分析的熱度也許可以從其全球市場規模中略窺一斑。根據市場研究機構Market Research Future的預測，到2030年，全球細胞周期分析的市場規模將達到163億美元，復合年均增長率達到9.80% (3)。

那么，細胞周期分析將如何推進您的研究項目？在此，我們將介紹一些有代表性的解決方案，以及分析工具和方法開發方面的最新進展。

流式細胞術

流式細胞術仍然是細胞周期分析時的主要工具。Cytek Biosciences公司流式細胞術分析和應用總監Kamala Tyagarajan表示：“Cytek Northern Lights全光譜流式細胞儀功能強大，不僅能夠開展高參數的多重分析，還能輕松運行傳統的低參數分析。”

“全光譜流式細胞儀采集每個熒光基團的整個光譜，而不像傳統儀器那樣檢測分散的波長。這為熒光染料和試劑的組合使用帶來了靈活性，即使發射峰重疊也沒問題。Cytek Northern Lights系統在檢測感興趣的群體方面具有高的靈敏度和分辨率，這對細胞周期分析非常重要，”Tyagarajan補充說。

傳統的細胞周期染料與流式細胞術兼容，但存在很大的限制，例如與活細胞分析不兼容。細胞增殖的指示物或標志物已成為替代的分子成像靶點，與細胞周期狀態相對應。據Sanderson介紹，alamarBlue能夠快速經濟地定量各個細胞系中的細胞增殖和毒性，用于時間進程研究，而且比四唑鹽（MTT）染料更安全。

“alamarBlue不會干擾細胞呼吸和功能，其專有的緩沖液使其高度穩定。在指示劑存在的情況下，細胞仍然能保持完整的功能和活力，可用于藥物敏感性和代謝研究等一系列應用，而且可輕松放大到高通量分析，” Sanderson談道。

Sanderson指出，alamarBlue的活性成分是刃天青（resazurin），這是一種具有細胞滲透性的無毒化合物，呈藍色且幾乎沒有熒光。在進入活細胞后，刃天青被還原，呈現紅色并發出強烈熒光。因此，通過這種試劑可檢測呼吸過程中的氧化水平，定量測定細胞活力和細胞毒性，直接反映了細胞健康狀況。

Absolute Biotech公司的首席科學官Frans Ramaekers強調，流式分析不再局限于細胞表面分子。他提到了該公司的FIX&PERM細胞固定和透化緩沖液。

“通過使用FIX&PERM，細胞內抗原的流式細胞分析也變得像表面抗原研究一樣簡單。FIX&PERM方案適用于研究外周血細胞樣本、骨髓抽吸物、單核細胞懸液以及用實體組織和培養細胞制備的細胞懸液，”他談道。

“一方面通過FIX&PERM來分析Ki-67和Bcl-2，另一方面利用廣泛的骨髓細胞分化標志物，研究人員能夠分析正常骨髓和骨髓瘤患者抽吸物中不同亞型的成熟造血細胞的增殖和抗凋亡活性，” Ramaekers繼續說。“這有助于人們更好地了解骨髓惡性腫瘤的潛在致病機制。”

成像流式細胞術

許多研究人員已將流式細胞術與微流控技術等其他模式相結合，以提高其在臨床實踐和基礎研究中的實用性。例如，成像流式細胞術克服了流式細胞術缺乏單細胞分辨率和光學顯微鏡通量較低的局限性(4)。

在一篇預印本文章中，Howell等人利用Cytek公司的ImageStream®X Mk II成像流式細胞儀來評估墨西哥利什曼原蟲（Leishmania mexicana）的DNA復制、細胞形狀和有絲分裂狀態(5)。

對于成像流式細胞術而言，如何優化數據分析的自動化是一項長期的挑戰。因此，Pozzi等人回顧了成像流式細胞術的數據分析挑戰，這些挑戰有望通過人工智能來解決(6)。

第一，圖像處理應當在微秒尺度上準確進行，以便根據衰老狀態等進行細胞分類。第二，輔助數據自動化將減少開發訓練數據集（如細胞周期的形態指標）所需的時間。第三，有必要進行實驗方案標準化，以促進各個實驗室之間的數據解讀。

質譜流式細胞術

質譜流式細胞術（mass cytometry）是質譜分析的一種變形，在細胞周期研究中越來越受歡迎。它不是像流式細胞術和顯微鏡分析那樣采用熒光（光學）檢測，而是采用同位素作為金屬標簽，在細胞霧化后進行定量。組織切片也可以霧化，從而提供生物標志物分布的擬圖像。

利用質譜流式細胞術，研究人員可以獲得細胞周期狀態及其他代謝特征的相關指標(7)。目前，這種方法可以同時分析多達50種生物標志物，而且不會出現光譜重疊或背景干擾(8)。

Abdul-Aziz等人評估了質譜流式細胞術在評估細胞衰老方面的作用(9)。他們在單細胞水平上定量了p16表達（癌癥研究的常見靶點）以及與細胞周期相對應的其他標志物。在WI-38細胞中，經過10天的氧化應激，S期的細胞數量減少，而G0期的細胞數量增加。由于單細胞質譜流式分析可以在數天內完成，研究人員認為，這種方法可能有助于血液腫瘤治療、干細胞移植及其他醫學治療的監測。

在癌癥和衰老等研究領域，細胞周期分析將繼續成為熱點。相關的數據分析可能帶來挑戰，尤其是高通量應用中或樣本存在大量異質性時。不過，目前的許多工具和方案（包括自動化技術）可以簡化這項任務。

參考文獻

1. Stallaert W, et al. (2022). The structure of the human cell cycle. Cell Syst. 13(3):230–240.

2. Chervov A and Zinovyev A (2022). Computational challenges of cell cycle analysis using single cell transcriptomics. arXiv preprint 2208.05229 (accessed Jan 8, 2024).

3. Market Research Future (2024). Cell cycle analysis market research report information by product (consumables, instruments, & others), application (cell identification and others), end-user (academics & research institutions, hospitals & diagnostic laboratories, & others) – Global forecast till 2030. Rep. MRFR/LS/0202-HCR, New York.

4. Rees P, et al. (2022). Imaging flow cytometry. Nat. Rev. Methods Primers 2:86.

5. Howell J, et al. (2023). The use of imaging flow cytometry for rapid, high-throughput and automated analysis of the Leishmania mexicana promastigote cell cycle provides new insights into cell cycle events of short duration. bioRxiv preprint 2023.07.24.550259 (accessed Jan 8, 2024).

6. Pozzi P, et al. (2023). Artificial intelligence in imaging flow cytometry. Front. Bioinform. 3:1229052.

7. Zhao Y, et al. (2022). Physical cytometry: Detecting mass-related properties of single cells. ACS Sens. 7(1):21–36.

8. Arnett LP, et al. (2023). Reagents for mass cytometry. Chem. Rev. 123(3):1166–1205.

9. Abdul-Aziz A, et al. (2023). Mass cytometry as a tool for investigating senescence in multiple model systems. Cells 12(16):2045.

（文章來源：www.ebiotrade.com/newsf/2024-5）