內質網（ER）是負責蛋白質折疊和運輸的重要細胞器。ER中的蛋白質折疊壓力，可能導致未折疊或錯誤折疊的蛋白質積累，即"ER應激"。這一情況會激活未折疊蛋白響應（UPR），這是由三個ER跨膜蛋白（IRE1α、PERK和ATF6）啟動的信號通路。然而，近年來的研究表明，UPR的激活并不總是由于ER應激引起，UPR也可能在沒有ER應激的情況下被激活。解碼ER應激與UPR之間復雜的關系，對于理解細胞在生理和病理狀態下的應激反應至關重要。
2024年6月11日，中國科學院生物物理研究所的王立堃團隊在《Cell Reports》雜志上在線發表了題為"Deciphering ER stress-unfolded protein response relationship by visualizing unfolded proteins in the ER"的研究論文。該研究開發了一種新型的熒光報告系統，能夠在活細胞中實時可視化ER腔內未折疊蛋白的積累。通過這一系統，研究人員能夠更好地理解ER stress與UPR之間的復雜關系，從而揭示在多種生理和病理條件下ER蛋白穩態的動態變化。
團隊開發了一種熒光報告系統，將ER應激信號傳遞蛋白PERK的ER腔內結構域（PERK(LD)）與綠色熒光蛋白（EGFP）和趨向形成六聚體的肽段（HOTag）融合表達，從而實現了在活細胞中實時檢測ER腔內未折疊蛋白積累。研究人員發現，當ER內的未折疊蛋白積累時，PERK(LD)會發生二聚化，帶動EGFP和HOTag形成明顯的熒光斑點。這一系統在HeLa和COS-7細胞中表現出高度的靈敏性和可逆性，能夠實時反映ER應激和UPR的動態變化。課題組進一步應用這一系統，檢測在不同應激條件下ER中的蛋白質狀態。例如，他們在模擬腫瘤微環境的低氧和酸性條件下，觀察到了未折疊蛋白的積累。他們還發現，盡管已有的研究表明棕櫚酸能以不依賴ER應激的方式觸發UPR，但棕櫚酸實際上仍會導致ER腔內未折疊蛋白的積累，這表明脂質雙層應激與ER蛋白穩態的紊亂是交織在一起的。
為了證明熒光報告系統確實是由未折疊蛋白聚集引起，研究團隊使用了多種技術手段，包括共定位實驗和免疫共沉淀，驗證了熒光報告系統與未折疊蛋白之間的直接結合。他們還發現，當過表達的PERK(LD)-EGFP-HOTag3與NHK（null Hong Kong mutant alpha 1 anti-trypsin，一個經典的ER定位的錯誤折疊蛋白）共表達時，能夠形成顯著的熒光斑點，進一步證明了該系統的特異性和敏感性。通過對NHK和其非糖基化版本的研究，課題組展示了該系統可以相對定量地檢測ER中未折疊蛋白的積累程度，并在不同濃度的條件下顯示出量效關系。此外，還探討了蛋白質翻譯抑制劑環放線菌酮（CHX）對斑點形成的影響。CHX能抑制蛋白翻譯，降低進入ER腔蛋白量，從而抑制ER腔內未折疊蛋白的聚集。研究人員發現CHX可以顯著抑制由ER應激引起的熒光斑點的形成，這表明該系統能夠反映ER蛋白質穩態的動態變化。
研究團隊進一步將熒光報告系統用于解析ER應激和UPR的關系。蛋白酶體抑制劑硼替佐米（Bortezomib）是一種抗癌藥。通常，蛋白酶體抑制劑通過阻礙ER相關蛋白降解（ERAD）來導致ER中未折疊蛋白積累，引發ER應激。然而，這與某些情況下觀察到的UPR抑制現象相矛盾。為了解釋這一現象，研究者用bortezomib處理穩定表達PERK(LD)-EGFP-HOTag3的HeLa細胞。結果顯示，盡管bortezomib誘導了eIF2α磷酸化和ATF4表達，但并未引起PERK磷酸化或XBP1 mRNA剪接，也沒有促進熒光斑點的形成，表明它未在ER中導致蛋白質錯誤折疊。此外，bortezomib顯著抑制了蛋白糖基化抑制劑tunicamycin處理細胞中的熒光斑點形成和UPR。相比之下，在MDA-MB-231細胞中，bortezomib促進了PERK的磷酸化和XBP1 mRNA剪接，并增加了斑點陽性細胞的比例。有意思的是在相同劑量的bortezomib處理下，MDA-MB-231顯示出明顯高于HeLa的凋亡水平。這表明不同細胞類型對bortezomib的UPR響應存在差異，而這也許與腫瘤細胞對這一抗癌藥的敏感性有關。這些結果揭示了Bortezomib在不同細胞類型中，通過不同機制調控UPR和未折疊蛋白積累的復雜性。此外，研究人員還觀察了不同濃度的ER鈣泵抑制劑thapsigargin (Tg)處理下，細胞中ER應激強度隨時間的變化。過去的研究表明，在持續的ER應激誘導劑刺激下，細胞中UPR信號-XBP1 mRNA剪接-的水平會出現先上升后下降的現象，但人們并不清楚XBP1 mRNA剪接水平的下降是因為ER應激的緩解還是IRE1-XBP1信號通路受阻。他們的結果表明，在低濃度Tg（0.01 μM）處理下，熒光斑點隨時間消失，表明ER穩態恢復；而在高濃度Tg（0.2 μM）處理下，熒光斑點持續存在，且細胞凋亡增加。這表明，在輕度ER應激下，UPR的減弱可能意味著穩態恢復，但在嚴重ER應激下，這可能表明ER傳感器失效，導致細胞死亡。
這項研究不僅深化了我們對ER應激和UPR機制的理解，還展示了如何通過創新的生物技術手段在細胞水平上直接觀察這些關鍵的生物過程。研究人員計劃進一步應用這一系統來探究在多種生理及生理病理條件下ER中的蛋白質狀態，尤其是在腫瘤、代謝疾病和病毒感染等背景下。綜上所述，這項研究揭示了ER 應激與UPR之間復雜的相互作用機制，為解碼這些過程如何在健康和疾病中發揮作用提供了一個強有力的工具。這一發現為開發新的治療策略提供了新的視野，特別是在涉及ER應激相關的疾病，如神經退行性疾病、糖尿病和癌癥等領域。
模式圖（引自原文）。該研究開發了一個熒光報告系統來觀察活細胞ER腔內未折疊蛋白的積累。在未折疊蛋白結合后，該系統快速且可逆地形成熒光斑點，實時可視化ER腔內未折疊蛋白的積累，幫助人們更好地理解ER應激如何與UPR相關。
中國科學院生物物理研究所的王立堃研究員為論文的通訊作者，博士生徐芬芬為第一作者。該研究得到了國家重點研發計劃、國家自然科學基金、中國科學院戰略性先導科技專項和青年交叉團隊項目的資助。
文章鏈接：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2024.114358
（文章來源:www.ebiotrade.com/newsf/2024-6/20240619070018980.htm） | 
