盡管近年來分子醫學的實踐已經取得了巨大的進步——反義寡核苷酸(ASO)療法的批準以及第一個基于CRISPR的療法證明了這一點——神經退行性疾病，如朊病毒病、亨廷頓病、阿爾茨海默病和帕金森病，仍然是一個艱巨的挑戰。毒性蛋白聚集與神經變性有關，這表明基因沉默是一種廣泛適用的治療策略。盡管ASOs和基于CRISPR的沉默提供了抑制致病蛋白表達的潛力，但尚未取得成功。

ASOs通過結合靶mRNA并誘導其降解、剪接修飾和其他改變其翻譯可用性的修飾來損害蛋白質合成。雖然臨床前療效已被證明與ASO治療。對于小鼠模型中的朊病毒疾病。到目前為止，在臨床上的成功要么是缺乏的，要么是有限的。ASOs也有很大的技術限制，包括其短期療效需要反復鞘內注射(進入椎管)和藥物不良反應的風險，如腦積水、腦膜炎和肝毒性?；贑RISPR的沉默技術提供了另一種方法，將催化死亡的Cas蛋白拴在效應域上。最初的“表觀遺傳編輯”嘗試使用的抑制因子結構域被證明只能使基因短暫沉默。

CRISPRoff是最近開發的一種表觀遺傳編輯器，它含有DNA甲基轉移酶結構域，可以通過啟動子的定點甲基化實現更持久的基因沉默。盡管取得了這些進展，但仍然存在一些重要的局限性:腺相關病毒(AAV)載體仍然是將轉基因傳遞到大腦的主要手段。CRISPRoff太大，無法裝入單個AAV載體；AAV載體促進長期編輯表達，帶來有害免疫反應和脫靶編輯的風險，組構活性效應酶的束縛可導致無節制的脫靶效應和細胞毒性。

甲基轉移酶(CHARM)是一種緊湊、無酶的表觀遺傳編輯器，可以招募內源性DNA甲基轉移酶，誘導靶基因啟動子的超甲基化，并在通過單個AAV載體遞送小鼠大腦后持久地沉默基因的表達，從而使其蛋白產物的產生。這種創新的方法解決了現有編輯方法的每個限制。

基于CRISPR的編輯工具由于其復雜性和大小而具有挑戰性。盡管含有mRNA的脂質納米顆?？梢杂行У貙⒋笮途庉嬈鬟f送到肝。目前它們瞄準其他器官(如大腦)的能力有限。為了實現高效的非肝臟遞送，需要多種AAV載體來容納大尺寸的表觀基因組編輯器，如CRISPRoff。但這種策略意味著降低效力，增加AAV劑量來補償，從而增加毒性。

通過擺脫CRISPR的使用，并創建一個模塊化的基于鋅指的“ZFPoff”表觀基因組編輯器，它不需要大的蛋白質結構域——鋅指DNA結合基序比Cas蛋白小得多。

使用系縛酶可以增加編輯效力，但可能產生不良后果。一個公認的例子是由CRISPR堿基編輯器進行的不依賴于引導RNA的脫靶編輯，其中束縛的脫氨酶結構域可以隨機改變整個基因組和轉錄組中的DNA和RNA序列。證實細胞毒性是CRISPRoff中使用的組成活性甲基轉移酶結構域[D3A，源自哺乳動物DNA甲基轉移酶3A (DNMT3A)蛋白]的問題，特別是在ZFPoff中與鋅指一起使用時。

根據DNMT3A調節的自然機制，從編輯器中移除D3A結構域，并使用非酶促DNMT3L c末端結構域(D3L)和組蛋白H3尾部的融合，它們一起將內源性和非活性DNMT3A特異性地招募到目標基因組位點并原位激活它，從而避免任何普遍的細胞毒性。D3L-H3尾部融合是相當小的，這意味著多達三個正交的表觀遺傳編輯器(針對不同的基因組區域)可以通過一些涉及分裂內鏈的巧妙工程融入一個AAV載體。

Neumann等人通過展示編輯工具長期表達可能帶來的潛在不良影響的自我沉默能力，克服了這些擔憂。他們讓其中一個編輯器靶向AAV載體中的啟動子，從而關閉所有編輯器的表達。CHARMs可以被編程來調節這種自我沉默，以優化治療性基因沉默和編輯器表達的短暫性之間的平衡。另一個安全優勢是CHARMs缺乏細菌表位（與基于CRISPR的工具不同），因此它們的免疫原性可能比其他表觀遺傳編輯器更有利。

在體內對PrP蛋白應用CHARM介導的表觀遺傳編輯時，確立了其有效性和持久性。AAV傳遞的CHARMs——包括自我沉默的CHARMs——靶向Prnp啟動子，實現了大腦中Prnp轉錄本和PrP蛋白水平的廣泛降低，并在治療后長達13周的時間內Prnp啟動子發生高甲基化?；谙惹暗墓ぷ?，預計這種效果將延長朊病毒病小鼠模型的生存期，也許對人類患者也是如此。

隨著CHARMs的發展，Neumann等人引入了一種強大且安全的基因沉默編輯技術，通過AAV傳遞到通常難以靶向的器官，如大腦。限制包括對通過甲基化對PRNP和其他疾病位點進行基因沉默的長期持久性的不確定性，這尚未得到保證，需要逐案確定。需要克服的額外挑戰是，基因沉默可能僅對某些疾病有用，并且鋅指引發的非目標編輯的潛力比CRISPR基工具定義得不那么明確。盡管如此，類似于CHARMs的表觀遺傳編輯器最終可能被證明對人類健康的影響與其他變革性技術一樣深遠，如堿基編輯和先導編輯。

An epigenetic editor to silence genes 


（文章來源：www.ebiotrade.com/newsf/2024-6/20240628100931013.htm）