| 什么是蛋白質磷酸化？
蛋白質磷酸化是在蛋白質激酶催化下，把ATP的磷酸基轉移到底物蛋白質氨基酸殘基(絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸)上，使蛋白質構象發生改變，產生活性進而行使功能的過程。而磷酸化的蛋白在蛋白磷酸酶的作用下又可以去磷酸
化，整個過程是可逆的。
蛋白質磷酸化有什么用？
蛋白質的磷酸化和去磷酸化是可逆性調節蛋白質功能的重要方式，幾乎涉及所有生理、病理過程，如細胞的生長發育、基因表達與調控、神經遞質的合成與釋放，甚至細胞癌變等。通過蛋白質的磷酸化與去磷酸化，細胞控制著信號的傳遞過程，進而影響細胞的生物學效應與功能，在生命活動中發揮著重要作用。
蛋白質磷酸化如何檢測？
在進行蛋白質磷酸化Western Blot分析檢測時，需要同時檢測磷酸化蛋白水平和該蛋白的總水平，但兩者分子量差距很小，使用化學發光方法進行檢測時，需要先使用磷酸化蛋白抗體進行孵育、檢測，之后進行剝離，再重新孵育該蛋白的抗體進行檢測。
既然化學發光Western Blot檢測法檢測磷酸化蛋白這么麻煩，那有沒有什么方法可以實現磷酸化蛋白快速便捷的檢測呢？
作者Xiomaris M. Cotto-Rios等利用LI-COR Odyssey 進行Western Blot，檢測了目的蛋白（抗原/抗體）是否表達、表達的特異性、表達量的高低。文中作者使用不同熒光基團標記的二抗，同時檢測了磷酸化蛋白水平和該蛋白的總水平，無需進行剝離及再孵育，大大縮短了磷酸化蛋白檢測的時間，實現了高效便捷的磷酸化蛋白水平和該蛋白的總水平檢測。由于藥物篩選實驗的高通量性，本文還用到了LI-COR In cell western（無需裂解細胞、制膠、上樣、跑膠、轉膜等步驟，直接在96孔/384孔板進行點Western Blot），進行高通量的Western Blot蛋白定性定量分析。
In-cell western 技術優勢
1、省時，直接在微孔板檢測，無需細胞裂解、跑膠和轉膜等過程；
2、高通量，一次可實現6*96/384個樣品檢測；
3、數據變異小，直接對細胞內的蛋白進行檢測，特異性好，靈敏度高；
4、雙通道同時檢測，不同熒光標記二抗同時檢測兩個蛋白
In-cell western 技術優勢
1、省時，直接在微孔板檢測，無需細胞裂解、跑膠和轉膜等過程；
2、高通量，一次可實現6*96/384個樣品檢測；
3、數據變異小，直接對細胞內的蛋白進行檢測，特異性好，靈敏度高；
4、雙通道同時檢測，不同熒光標記二抗同時檢測兩個蛋白
文章研究背景
BRAF激酶是眾所周知的ERK信號通路的關鍵效應因子，在許多癌癥中被過度激活。然而在許多腫瘤中，BRAF二聚體也會介導ERK信號傳導。因此有些FDA批準的RAF抑制劑對BRAF二聚體的抑制效果不佳，從而也會導致腫瘤的耐藥性。Ponatinib（普納替尼）是FDA批準的藥物，是BRAF單體和二聚體的有效抑制劑，Ponatinib可結合BRAF二聚體，并通過與先前未發現的變構位點相互作用來穩定一個獨特的αC-螺旋構象?；谏鲜鲆言诮Y構方面取得的研究成果，接下來要介紹的這篇文章，作者研究開發了一種新的BRAF抑制劑—PHI1，與Ponatinib都將更有助于對BRAF依賴性腫瘤的治療。
部分數據展示
RAF二聚體激酶抑制劑的篩選
首先為了實現對RAF二聚體激酶抑制劑的鑒定，作者使用SKMEL239-C4黑素瘤細胞建立了基于In cell western篩選的測定方法（見下圖a、b）。在 Vemurafenib（維莫非尼，BRAF選擇性抑制劑）誘導的抑制BRAF的選擇壓力下，允許表達p61BRAF（p61BRAF對Vemurafenib病毒有抗藥性，可在患者的腫瘤中發現）的細胞優先生長，即這類細胞可產生BRAF的剪接突變體，其以不依賴于RAS的方式通過二聚體形式進行信號通路轉導。對未經藥物處理或用增加濃度的 Vemurafenib處理過3小時的SKMEL239-C4細胞，測定其細胞內的蛋白磷酸化水平。微孔板的In cell western圖像顯示的是細胞中磷酸化ERK1(綠色)和總ERK1(紅色)的熒光抗體孵育后的表達情況及其合并圖像(圖2c)?；诹姿峄疎RK (p-ERK)和總ERK熒光讀數的 In cell western ，檢測到的信號動態范圍廣泛，并且在低濃度的 Vemurafenib下重現了SKMEL239-C4細胞的p-ERK 抗性。相反，Trametinib，一種FDA批準的MEK抑制劑，在低nM濃度下有效地抑制ERK信號傳導(圖2e)。作者使用具有非抑制濃度的Vemurafenib作為陰性對照和0.1μM Trametinib陽性對照的96孔格式，獲得0.68的Z因子(圖2f)。作者發現 ，Ponatinib是一種有效的BRAF抑制劑，具有與其他RAF抑制劑相似的效力。
Ponatinib能有效抑制致癌性BRAF
接下來，檢測Ponatinib依賴于BRAFV600E，p61BRAFV600E和 RASMUT/BRAFWT的ERK信號傳導抑制腫瘤細胞的能力。為了與BRAFV600E單體的有效抑制劑進行比較，作者使用了Vemurafenib。Ponatinib在0.3-0.5μM的劑量下抑制BRAFV600E和p61BRAFV600E依賴性黑素瘤細胞中的ERK信號傳導。然而，需1-3μM的劑量才能有效抑制RASMUT/BRAFWT黑素瘤或肺癌細胞中的信號傳導，這表明由于RAF引發的一些抗性與其他αC-IN 抑制劑類似(圖3a)。
Ponatinib抑制ERK信號傳導而不降低SKBR3細胞中的RASWT-GST水平，而Lapatinib抑制ERK信號傳導并如預期的那樣顯著降低RASWT-GST水平(圖3b)。
用設計的抑制劑開發BRAF變構部位
基于對Ponatib-BRAFV600E 二聚體結構的認識，進一步開發已鑒定的BP-IVallosteric位點。通過KinomeEDGE篩選和SelectScreen等研究結果表明，BRAF構象的特異性結構變化以及PHI1與αCallosteric位點的相互作用導致PHI1對BRAF對其他激酶的特異性增加。
最后，評估PHI1對肺腺癌H2087和H1666細胞以及由RASMUT/BRAFWT驅動的SKMEL-2和SKMEL-30黑素瘤細胞系的抑制作用。在非康奈非尼處理的細胞中，檢測到PHI1的低p-ERK抑制(圖5a，b)。相比之下，在康奈非尼預處理后，PHI1在H2087和H166肺癌細胞系中均表現出亞微摩爾p-ERK抑制，在H2087中具有更顯著的作用(圖4a，b)。綜上所述，這些結果表明PHI1對BRAF二聚體的第二位點具有獨特的特異性，并且在不同類型的BRAF抑制劑之間具有明顯的正協同抑制機制。
LI-COR Biosciences公司在近紅外熒光成像領域已有25年的積淀。
25年來，LI-COR Odyssey®雙色紅外激光成像系統由于可實現Western Blot精確定量，多重Western Blot檢測，且重復性更高，通量更高，擁豐富的應用范圍，因而得到了全球生物醫學研究人員的信賴。
豐富的多功能應用
(文章來源：www.ebiotrade.com)
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