簡介

        HTRF是基于時間分辨熒光共振能量轉移（TR-FRET）的檢測系統，廣泛用于分析不同分子間相互作用和結合的研究。該技術基于長壽命的銪或鋱穴合物供體與各種紅色或者綠色受體間的能量轉移，并結合了FRET和TRF兩種技術的優勢。

        HTRF技術需要多功能酶標儀具備很高的靈敏度，Spark酶標儀的一系列特性可以滿足這些需求，并確保最佳的分析性能。Tecan獨特的融合光學系統，在同一機身上整合了濾光片的靈敏度和單色儀（MCRs）的靈活性。除了單獨完全使用基于濾光片型檢測或MCR檢測外，還可以在同一次檢測中同時組合使用這兩種檢測方法。自動Z軸優化和集成二向色鏡非常適合HTRF檢測，進一步提高了Spark卓越的靈敏度。本應用指南描述了配備標準熒光組件的Spark酶標儀用于HTRF檢測的驗證。

材料與方法

        • 帶標準熒光模塊的Spark多功能酶標儀（Tecan，奧地利）

        • 384孔小體積微孔板，黑色和白色（Greiner® Bio-One，

德國）

        • HTRF酶標儀質控試劑盒 （Perkin Elmer cisbio，法國）

        • cAMP HiRange檢測試劑盒（Perkin Elmer cisbio，法國）

        • Human TNFα檢測試劑盒（Perkin Elmer cisbio，法國）

        • IP-One Tb檢測試劑盒（Perkin Elmer cisbio，法國）

     • cAMP-green酶標儀質控試劑盒（內部使用非商用，Perkin Elmer cisbio，法國）

HTRF 酶標儀質控試劑盒(RCK) 

        HTRF酶標儀質控試劑盒旨在設置和驗證儀器進行HTRF測量的兼容性。它包含評估單臺酶標儀性能所需的所有試劑和緩沖液，也可用于不同儀器的比較。

Human TNFα檢測試劑盒

        腫瘤壞死因子- α (TNFα)是一種由活化的巨噬細胞和單核細胞分泌的細胞因子，作為急性期免疫應答的一部分參與全身炎癥反應。

        該檢測試劑盒允許通過抗體介導識別用HTRF供體和受體熒光基團標記的兩個不同的表位來定量細胞或上清液中的TNFα。HTRF比值隨TNFα濃度呈線性增加。

cAMP HiRange檢測試劑盒 

        環腺苷酸（環腺苷酸3' -5' -單磷酸，cAMP）是細胞內最重要的信使分子之一，參與蛋白激酶或離子通道的激活等多種生物過程。本試劑盒設計用于通過競爭性免疫分析方法直接定量懸浮細胞或貼壁細胞中的cAMP，可檢測不同細胞系中GPCRs(G蛋白偶聯受體)的激動劑和拮抗劑作用。HTRF信號與樣品中cAMP濃度成反比。

IP-1 Tb檢測試劑盒

        G蛋白介導的信號傳導通路主要有三種，通過G蛋白的四個亞型來介導：Gs、Gi、Gq和G12/13。Gq在GPCR刺激后誘導磷脂酶C(PLC)激活，觸發IP3（三磷酸肌醇）的生成。IP1（磷酸肌醇，IP3的下游代謝物）會在Gq受體激活后在細胞中積累。它在氯化鋰(LiCl)存在下是穩定的，因此是GPCR (Gq)功能試驗的理想選擇。

        IP-One Tb試驗是一種競爭性免疫檢測，使用鋱穴合物標記的抗IP1單克隆抗體和d2標記的IP1檢測累積的IP1。信號比與樣品中IP1濃度成反比。

試驗方案

        所有試劑盒都是根據試劑制造商的說明使用的。為了驗證鋱供體/綠色受體結構，將cAMP直接偶聯到綠色受體，與鋱供體偶聯的抗cAMP抗體結合使用。每種試劑盒在384孔微體積板(白色和黑色)中檢測三次，每孔填充20μl。Spark通過使用融合光學濾波片/濾光片組合，以及激發側的MCR和發射側的濾波片進行了驗證。

        使用銪穴合物供體的試劑盒- RCK、cAMP HiRange試劑盒和TNFα試劑盒的檢測參數見表1。

使用銪穴合物供體的檢測參數

        使用鋱穴合物供體（IP-One Tb試劑盒和cAMP + 綠色受體）的檢測參數詳見表2。

        使用鋱穴合物供體的檢測參數

實驗結果

HTRF酶標儀質控試劑盒

        在發射端選擇濾光片的條件下，Spark酶標儀呈現非常好的RCK實驗結果。而激發端選擇濾光片和MCR均符合Cisbio的接受標準。因此在濾光片/濾光片和單色儀/濾光片兩種組合下對Spark酶標儀的HTRF進行驗證。

     結果顯示，Spark酶標儀適用于HTRF分析。在兩種檢測模式下，使用白色酶標板和黑色酶標板，Spark酶標儀均符合Cisbio的RCK 檢測標準（表3）。使用白色酶標板和黑色酶標板，所有設置均顯示非常好的檢測范圍（FLow  37%，ΔF High ≥ 1,045%）和最小的檢測誤差（所有校準器和標準的CVs 濾光片/濾光片組合 ≤ 3.1%，單色儀/濾光片組合 ≤ 6.3%）。

Human TNFα 檢測試劑盒

        Human TNFα 檢測試劑盒是驗證過程中最靈敏的測試方法，需要高靈敏度的酶標儀。根據評估方案，TNFα的檢測極限是基于校準系數1到3計算。在濾光片/濾光片組合下，使用白色和黑色酶標板的檢測極限均低于20 pg/ml。單色儀/濾光片組合下，使用白色酶標板超過Cisbio的標準（表4）。因此單色儀/濾光片組合下的檢測使用白色酶標板，濾光片/濾光片組合下可使用白色和黑色酶標板，TNFα稀釋檢測在20和100pg/ml之間呈現線性關系（R2 ≥ 0.9979）(圖1)。

cAMP HiRange 檢測試劑盒

        如圖2所示，cAMP稀釋系列得到的F值與cAMP濃度呈負相關。得到的S型曲線是典型的競爭法測定結果。具體的測試結果詳見表5。在每一種情況下，實現了信號空白比20的足夠的動態范圍，EC50值<25 nM。白色酶標板在兩種融合光學配置下呈現非常好的實驗結果，而黑色酶標板在濾光片組合下的F和S/B值更低。

IP-One Tb 檢測試劑盒

        IP-One Tb試劑盒用于分析Spark在檢測鋱穴合物供體與紅色受體實驗的性能。在濾光片/濾光片和單色儀/濾光片組合下使用白色酶標板以及濾光片/濾光片組合下使用黑色酶標板均符合Cisbio的性能標準（表6）。圖3顯示典型的IP1標準曲線。使用白色酶標板在濾光片/濾光片組合下達到最好的性能，其他條件下的檢測結果顯示減少的F、S/B和EC50值。

cAMP green 酶標儀質控試劑盒

        cAMP green 酶標儀質控試劑盒使用與cAMP綠色受體偶聯的鋱抗cAMP共軛物。該試劑盒用于分析Spark酶標儀的HTRF（鋱供體和綠色受體）檢測性能。所有的融合光學組合符合Cisbio的標準（表7），但在不同的組合下，黑色微孔板的S/B和EC50值略低于白色微孔板。黑色微孔板在競爭性實驗曲線中的F值也明顯偏低（圖4）。

結論

        創新型Spark多功能酶標儀采用Tecan獨特的融合光學系統提供給客戶更優的解決方案。

        激發和發射均選擇濾光片的條件下，系統在白色和黑色酶標板上呈現優質的實驗結果。在激發端選擇MCR和發射端選擇濾光片的條件下，使用白色酶標板也符合HTRF的檢測標準。因此這些組合可視為通過了HTRF驗證。除了銪供體的試劑盒外，使用鋱供體加紅色和綠色受體也可進行穩定靈敏的定量。

        綜上所述，本文的研究結果表明，采用獨特融合光學系統的Spark酶標儀采用濾光片作為發射端，完美適用于各種不同的HTRF熒光檢測。

縮略語表

lHTRF    均相時間分辨熒光

lTRF       時間分辨熒光

lFRET     熒光共振能量轉移

lMCR     單色儀

lRCK      酶標儀質控試劑盒

lcAMP    環腺苷酸3' -5' -單磷酸

lIP3        三磷酸肌醇

lIP1         磷酸肌醇

lGPCR     G蛋白偶聯受體

lTNF­        腫瘤壞死因子- α

lPLC         磷酯酶C