簡介

     蛋白質之間的動態相互作用是多種細胞功能的關鍵媒介，幾乎與所有的生物過程都相關。因此，它們是研發新型藥物治療的有價值靶點。在這種背景下，Promega開發的生物發光共振能量轉移（BRET）是一種成熟的檢測技術，用于研究活細胞中的蛋白質相互作用。然而，由于其有限的動態范圍和靈敏度，其應用推廣至今仍受到一定的阻礙。

        隨著最新的極其明亮的NanoLuc®熒光素酶的出現，用其與一種帶有長波長熒光團的細胞內蛋白質結合的標記方法， P r o m e g a 將B R E T 技術帶到了一個新的水平：NanoBRET™。

        由于其尺寸?。?9 kDa）、發射強度高且光譜（460nm峰值強度）相對狹窄，NanoLuc®熒光素酶成為理想的能量供體。一種高效紅光發光受體熒光團（635nm峰值強度）使整個BRET光譜分離超過175nm（見圖1）。相比其他BRET分析技術，它整合了更大的光強度與改進的光譜分辨率，因此顯著提高了檢測結果的靈敏度，并使其達到了更高的動態范圍 [1]

        NanoBRET™靶位結合細胞內HDAC試驗，測試的是完整細胞內可與選定目標HDAC蛋白結合的化合物的親和力，該化合物可競爭性地取代細胞中與NanoLuc®融合蛋白可逆結合的NanoBRET™示蹤劑。隨著最新的極其明亮的NanoLuc®熒光素酶的出現，用其與一種帶有長波長熒光團的細胞內蛋白質結合的標記方法， P r o m e g a 將B R E T 技術帶到了一個新的水平：NanoBRET™。

        在試驗的第一步，向表達所需NanoLuc®融合蛋白的細胞中加入固定濃度的示蹤劑。競爭性化合物的引入導致NanoBRET™能量轉移的劑量依賴性下降，以此估計靶蛋白的胞內親和力。NanoBRET™TE細胞內HDAC試驗評估化合物與組蛋白去乙?；福℉DAC）—NanoLuc熒光素酶融合蛋白[2]的結合。在本應用指南中，我們在Spark多功能酶標儀上演示了用于評估化合物與HDAC6（一種與癌細胞轉移和腫瘤發生相關的組蛋白去乙?；福┙Y合的方法。

        Spark酶標儀是Tecan公司的多模塊檢測平臺，可為基于發光的檢測應用提供卓越的性能，包括閃光和輝光發光、多色發光和發光掃描[3,4]。專用光電倍增管（PMT）允許單光子計數，消除了通常與使用單個PMT進行熒光和發光測量的儀器相關聯的靈敏度和動態范圍之間的沖突。這種獨特的光學組合成就了優越的靈敏度，可與獨立的光度計相媲美。該酶標儀配備了專門針對NanoBRET應用的優化升級款發光濾片。

        本應用指南總結了使用Spark酶標儀和NanoBRET檢測技術實施NanoBRET™靶位結合細胞內HDAC試驗的一系列測試結果。

材料和方法

• HEK293細胞穩定表達HDAC6-NanoLuc®融合蛋白
• NanoBRET™ TE細胞內HDAC檢測試劑盒（Promega,Cat# N2080）
• 包括NanoBRET™Nano-Glo®底物，示蹤稀釋緩沖液，NanoBRET™細胞內TE HDAC示蹤劑，和細胞外NanoLuc®抑制劑
• Opti-MEM® I減血清培養基，無酚紅（Fisher, cat#11058021）
• SAHA （亞?；桨妨u肟酸）/ Vorinostat（Sigma, cat#
SML0061, 配制為10mM DMSO原液）
• Panobinostat （Selleck Chemicals, cat# S1030, 配制為10mMDMSO原液）
• Costar® #3917 96孔白色帶蓋組織培養處理板（Fisher, cat#07-Spark-628）
• 各種單通道和多通道移液器和槍頭，移液槽

        將HEK293細胞穩定表達HDAC6-NanoLuc®融合蛋白在不含血清或酚紅的Opti-MEM培養基中重懸至密度為2x105個/mL。將85μl的細胞懸液（17,000個細胞/孔）轉移到康寧實驗板的孔中。將80 μl的NanoBRET™細胞內TE HDAC示蹤劑和320 μl的示蹤稀釋緩沖液結合制成20X NanoBRET™示蹤劑，在所有實驗孔中加入5 μl的NanoBRET™示蹤劑。 

         將10mM原液含有Panobinostat和亞?；桨妨u肟酸（SAHA）測試化合物在Opti-MEM中稀釋至200 μM，然后在Opti-MEM中按1:3連續滴定，形成10X濃度11-pt劑量反應滴定。將稀釋后的化合物10 μl一式三份加入實驗孔中。不含化合物的對照孔中也添加10 μl培養基。

        將檢測板以700轉/分的速度混勻振蕩15秒，然后置于37°C/5% CO2培養箱中孵育85分鐘。 

        孵育后，將測定板從培養箱中取出，使其在室溫下平衡15分鐘。

        在室溫平衡過程中，將30 μl的NanoBRET™Nano-Glo®底物和10 μl的胞外NanoLuc®抑制劑與4.96 ml不含血清或酚紅的Opti-MEM結合制成3X完整底物加抑制劑溶液。在所有實驗孔中加入50μl 該3X完整底物加抑制劑溶液。

        將檢測板以700轉/分的速度混勻振蕩15秒，然后在室溫下孵育2分鐘，然后測量NanoBRET。 

        根據試劑盒說明書[2]制備NanoBRET TE細胞內HDAC檢測試劑盒并移液到Costar白色96孔平底微孔板中，總檢測量為150 μl。在In nite Spark上進行檢測的參數設置如表1所示。

結果和討論

        使用Spark對每個微孔依次讀取供體和受體波長。手工計算BRET比值，將比值結果乘以1000轉換為milliBRET單位（mBU）。

        已知的HDAC抑制劑Panobinostat和SAHA都會與HDAC6結合，導致BRET比值的劑量依賴性變化。高濃度的兩種化合物取代了細胞內的HDAC示蹤劑，導致BRET[3]降低。測得Panobinostat和SAHA的EC50值分別為1.42 μM和0.54 μM（見圖3）。隨著藥物濃度的稀釋，對示蹤劑結合的競爭變得不那么明顯。較低濃度的化合物取代較少的示蹤劑，使得供體NanoLuc®熒光素酶和示蹤劑之間發生能量轉移。

        總之，供體（NanoLuc®熒光素酶）和受體（示蹤劑）的發光信號過濾后的波長均可被檢測到。因此，Spark多功能酶標儀是適用于NanoBRET™檢測的。

參考文獻

        1) Machleit et al. NanoBRET–A novel BRET platform for

the analysis of protein-protein interactions. ACS Chem.

Biol., 2015, 10 (8), pp 1797–1804

        2) NanoBRET™ Target Engagement Intracellular HDAC

Assay. Technical Manual/Instructions for Use. 6/16,

TM483 (Promega)

        3) Unparalleled flexibility for luminescence detection wit h

the Spark™ multimode reader. Technical Note. 398597

V2.0. 01-2017 (Tecan)

        4) Spark® multimode reader - luminescence sensitivity.

Optimizing the detection limits for flash and glo w

luminescence. Technical Note. 398751 V2.0. 01-2 017

(Tecan)

        5) Implementation of NanoBRET assay technology the

Infinite 200. Application Note. 400193 V1.0 04 -2017

(Tecan)


（文章來源：hmez.huimeihealth.com.cn/hm/scrm/scrmmobile/eda/1654307552964694016）