簡介

單克隆抗體在生物制藥領域越來越受歡迎，在發現潛在有效的治療性單抗的研發過程中，需要篩選大量的候選單抗。因此需要準確、快速和高通量的檢測方法用于定量IgG和含Fc片段蛋白?，F有的IgG/Fc片段定量方法包括：HPLC、表面干涉法、ELISA和TR-FRET，這些方法存在一些缺點，比如有的價格昂貴、有的耗費勞動力和時間。

Valita TITER方法為直接在細胞培養上清中檢測和定量IgG和含Fc片段蛋白提供了一種非常精準且經濟高效的解決方案。該方法采用熒光偏振技術檢測IgG和Fc片段與G蛋白的相互作用，線性檢測范圍為2.5至100mg/L。分析在96孔板中進行，提供簡單、高通量、快速且全自動化處理，樣品量要求低，無需繁瑣的制備過程。

在本應用指南中，我們介紹了在Spark®和Infnite® 200PRO多功能酶標儀上使用Valita TITER試劑盒定量檢測IgG/Fc-蛋白的優化方案。

Spark多功能酶標儀是Tecan的一款高端儀器，可以提供多種配置。采用先進的模塊化可升級設計，可以輕松地處理常規和復雜的檢測。Spark獨特的Fusion Optics是第一款將單色儀的靈活性與濾光片的靈敏度結合在同一臺儀器內的解決方案。這種高度多功能性設計確保了實驗研發和優化，即使在低信號范圍內也可以實現熒光檢測應用的高靈敏度。

Infinite PRO是一款操作方便的多功能酶標儀，最常用的檢測模式如光吸收、熒光和化學發光，提供經濟且高性能的檢測。該平臺一直致力于追求卓越，已經發展為一個經濟實用的酶標儀家族，包含了六種以應用劃分的配置。在Infinite 200 PRO上使用Valita TITER試劑盒，應選擇Infinite F Plex配置。

實驗原理

Valita TITER是一種快速、高通量的檢測方法，它通過熒光偏振法（FP）對IgG-Fc與IgG結合肽的相互作用進行測定。

熒光偏振法可以有效地分析分子大小的變化。當熒光標記分子受到平面偏振光激發，發射出相同偏振平面的光，則分子在整個激發態中保持靜止。相反，如果分子在激發態中旋轉并翻轉出該偏振平面，會發射出與激發光不同平面的光。小分子在溶液中的翻滾速度比大分子快，因此可以使用光的去極化程度來測量與熒光團相關的分子大小的變化。

在本實驗中，沒有發生結合的帶熒光標記的多肽與發生結合的IgG-多肽相比，轉動更快并且去偏振更多（大五倍）?？赏ㄟ^計算偏振激發光源的平行面（偏振部分）和垂直面（去偏振部分）中發射的光強度之間的歸一化差來計算，通常以毫偏振單位（mP）表示。

材料和方法

• ValitaTITER 試劑盒

• ValitaAPP 軟件

• IgG 標準品(人血清)

• Spark 多功能酶標儀

• Infinite 200 PRO 多功能酶標儀(F Plex 配置)

實驗步驟

根據使用說明書準備樣品。按照Valita TITER 試劑盒說明繪制8點IgG標準曲線。簡單地說，在Valita TITER微孔板的每個孔中加入60 l Valita Mab重組緩沖液以及60 l標準品?；靹虮芄夥跤?0分鐘后，在Spark和Infnite 200 PRO酶標儀中，分別采用Spark Control™和i-control™預置的方案進行檢測，參數設定詳見表1。然后使用Valita APP 軟件對導出的原始數據進行分析。

G因子用來補償光學組件對平行和垂直偏振光的不同響應。G因子計算是熒光偏振測量中一個重要的因素。雖然它可以手動設置，建議在開始樣品測量之前對FP測試中使用的特定熒光基團執行一個G因子校準。

G因子與波長相關，方法中至少需要一個包含熒光基團的微孔（參照），和一個只包含緩沖溶液沒有任何熒光基團的微孔（空白參照）。一旦為一個特定的熒光基團計算出G因子，這個值可以用于以后所有相同熒光基團的測量。

結果

將Valita TITER法與被廣泛認為是金標準的HPLC法的結果做比較（圖4）。HPLC法和Valita TITER法的相關性顯示這兩種方法的精度類似，而Valita TITER法由于其同質性不需要復雜的樣品制備，更加快速、高通量和操作簡單。

結論

實驗表明Spark和In?nite 200 PRO展出優秀的分析性能，提供了一個定量IgG和含Fc片段蛋白的高通量、易操作和低成本的解決方案。此外，該方法直接測定細胞培養上清液，不再需要復雜的樣品制備步驟。



（文章來源：hmez.huimeihealth.com.cn/）