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蛋白質組學研究內容主要是解析基因組全部的蛋白質組，并通過蛋白定量和定性上變化反映細胞、器官和有機體的生理變化；轉錄后調控和翻譯后修飾使得組成蛋白的數量遠遠大于組成基因的數量。隨著生物質譜技術迅速發展，質譜技術已經逐漸成為了蛋白質組學分析的主流技術。

近期蛋白組學領軍人物Matthias Mann團隊在《Molecular & Cellular Proteomics》特約專欄發表了題為“MS-Based Proteomics of Body Fluids: The End of the Beginning”【1】的最新綜述，總結了不斷成熟的樣本前處理、蛋白檢測、數據分析方法，展望了基于質譜的體液蛋白質組學走向臨床應用的廣闊前景。

a) 擴展性、穩健性和重復性：
在體液蛋白質組學中，考慮到不斷增長的研究隊列，在可管理的時間框架內確保一致、無污染和可靠的樣品制備質量尤為重要。事實上，體液的應用總體上推動了基于質譜的蛋白質組學的品質追求。如今，全自動或半自動化的液體處理機器人已經得到了廣泛的應用。同時，樣品制備過程也得到了簡化和精簡。

b) 高豐度蛋白挑戰：

在血漿或血清中，以及在較小程度上在其他體液中，少數高度豐富的蛋白質占了定量肽強度的絕大部分，極大地損害了較少豐富的蛋白質的檢測【2】。面對高豐度蛋白的挑戰，除了常規的去除高豐度蛋白排除其信號干擾以達到檢測低豐度蛋白的目的，還有通過具有特定表面化學結構的納米顆粒也被用來選擇性地富集低豐度的蛋白質。例如Seer平臺基于磁珠富集的ProteoMiner蛋白富集試劑盒，當樣本分成多組分進行檢測時，可以達到數千個血漿蛋白的鑒定深度【3】。

體液蛋白質組學的最新工作流程改進

二、蛋白檢測

a) DIA:

近年來，質譜儀和采集方案共同發展，數據獨立采集(DIA) 質譜的成熟和廣泛采用標志著一個重要的里程碑。這一進展主要是由新算法和高性能質譜儀的發展推動的。DIA固有的定期采樣所有前體的能力使得肽片段離子的采樣更加均勻，從而提高了數據的完整性，增強了蛋白質組的深度，并提高了靈敏度。

b) 多路參考信道:

非等壓多路DIA (mDIA)是最近的一項發展，有望將DIA的優點與多路復用的優點結合起來。這里用二甲基試劑創建了MS1可識別的通道，允許將樣品匯集起來進行測量，并添加參考蛋白質組。通道因其特有的質量位移而相互聯系。在每個質譜測量中，參考蛋白質組的鑒定延續到樣品通道，消除了對其鑒定的需要。此外，參考通道可以實時監控分析性能。由于在所有樣本中都是相同的，因此它可以作為研究樣本之間甚至研究和實驗室之間進行定量比較的橋梁。不同的參考蛋白質組也可以相互“翻譯”或通過一起測量來“協調”。對于絕對定量，參考蛋白質組中的蛋白質子集可以與絕對標準相關。

c) 親和結合物:

在過去的幾年中，親和結合劑技術已被廣泛用于測量大型臨床血漿或血清隊列——主要是Olink的基于抗體的鄰近延伸測定(PEA)或SomaLogic的基于DNA適配體的SOMAscan測定【4】。許多質譜研究都是小型的和專門的，而親和結合劑研究是相當昂貴的，但仍然被用于大型隊列。

d) 生物標志物panel

多種生物標志物的組合被稱為“體外診斷多變量指數測定”。無偏好性的蛋白質組學通常會產生一組生物標志物，這些生物標志物單獨具有較小的折疊變化，但結合起來可以在體液蛋白質組學中捕獲足夠的信息，以解決混雜因素并準確診斷疾病狀態。體液蛋白質組是多維的，受遺傳學、性別、年齡、生活方式、既往疾病或治療等因素的影響，生物標志物panel本質上更適合解決這種復雜性。

多路參考通道

三、數據分析方法

a) 大隊列協同與矩形策略：

矩形策略利用大隊列來更好地發現真正的生物標志物。檢測區分病理病例和對照組的生物標志物面臨著由混雜因素引入的變異性或偏差帶來的挑戰。在小隊列中，病例和對照組之間的明顯蛋白質組差異可能由隨機混雜變異性主導。在大型隊列中，這種隨機性被大量稀釋，導致感興趣的真實效應和生物標志物候選物占主導地位，在進一步的獨立隊列中具有更好的驗證前景。

大隊列協同與矩形策略

b) 研究模擬現實的集體和分析：

研究集體需要與所研究的疾病和預期應用相匹配。例如，有些疾病是作為一系列或連續的表型出現的，或逐漸表現出來的，而對照者可能有不同程度的患病風險，甚至受某種疾病的影響。這可能需要縱向隊列或比較多個條件，而不是依賴于病例和對照的二元分類。此外，復雜的場景可能只能通過大規模研究集體支持的基于人群的理解來解決。大的隊列可以研究具有挑戰性的場景。這些包括小效應量、用于鑒別診斷或結果分析的多種條件的比較、縱向變化、用于篩選應用的非常高的測試準確性的驗證，或在群體水平上理解表型。

大隊列可研究場景

四、未來展望

體液蛋白質組學的許多挑戰現在已經被克服，許多研究已經在獨立的隊列中得到了驗證。生物標志物雖仍集中在高豐度范圍內，但也表明隨著技術的進步正在將可檢測的體液蛋白質組的邊界推向較低豐度范圍，還有更多的生物標志物等待發現。曾經的挑戰已變為財富，基于質譜的體液蛋白質組學已做好準備走向未來。

參考文獻：

【1】Jakob M. Bader, Vincent Albrecht, Matthias Mann,MS-Based Proteomics of Body Fluids: The End of the Beginning,Molecular & Cellular Proteomics,Volume 22, Issue 7,2023,100577,ISSN 1535-9476, https://doi.org/10.1016/j.mcpro.2023.100577.

【2】J.M. Bader, P.E. Geyer, J.B. Müller, M.T. Strauss, M. Koch, F. Leypoldt, et al.Proteome profiling in cerebrospinal fluid reveals novel biomarkers of Alzheimer’s disease. Mol. Syst. Biol., 16 (2020), Article e9356.

【3】S. Hartwig, A. Czibere, J. Kotzka, W. Paßlack, R. Haas, J. Eckel, et al. Combinatorial hexapeptide ligand libraries (ProteoMiner): an innovative fractionation tool for differential quantitative clinical proteomics Arch. Physiol. Biochem., 115 (2009), pp. 155-160.

【4】L. Dayon, O. Cominetti, M. Affolter Proteomics of human biological fluids for biomarker discoveries: technical advances and recent applications .Expert Rev. Proteomics, 19 (2022), pp. 131-151 .

（文章來源：mp.weixin.qq.com/s/BbOCG2bs4I9qY1SzW8_cQw）