心血管健康（Cardiovascular health, CVH）在人的整個壽命中起著至關重要的作用，尤其是自年輕成年期開始的心血管健康狀況，與個體未來心血管疾?。–ardiovascular disease, CVD）的風險及總死亡率有著強烈的相關性。研究表明，維持理想的心血管健康水平至中年甚至能基本消除剩余的終生CVD風險，并帶來更長的健康壽命，降低全因死亡率和醫療支出，提高老年時的生活質量。

然而，研究還發現，心血管健康從兒童時期到年輕成年期間顯著下降，在到達中年時，只有不到5%的美國人能夠保持高水平的心血管健康。因此，預防成年期心血管健康的損失或中斷不良心血管健康向亞臨床心血管疾病的轉變可能在大幅減少CVD發病率和死亡率方面發揮重要作用。

DNA甲基化是一種眾所周知的表觀遺傳修飾，它作為環境暴露的調節性修改能影響基因表達。環境及生活方式因素已與血液DNA甲基化生物標志物的變化相關聯，而這些甲基化的變化可能在分子層面上記錄了個體整體的心血管健康狀態。這些表觀遺傳變化因此可能代表了心血管健康暴露、基因表達模式控制以及未來CVD發展之間的重要潛在生物學聯系。

本研究的主要目標是明確年輕成年期到中年的累積心血管健康暴露與中年期反復測量的全基因組DNA甲基化模式之間的關聯，進一步理解這些表觀遺傳變化是如何介導從較差的心血管健康到亞臨床CVD的過渡。

縱向隊列研究：使用CARDIA（Coronary Artery Risk Development in Young Adults, 青年冠狀動脈風險的發展研究）研究的數據集，其中包括1085名參與者的血液DNA甲基化數據，這些數據在15年（Y15）和20年（Y20）的兩次檢測中獲得。此外，采用來自FHS(Framingham Heart Study, 弗萊明翰心臟研究)研究的數據集作為數據分析時的對照組。

臨床CVH評分定義：結合體重指數、血壓、總膽固醇和空腹血糖四項指標，從年輕成年期至中年期計算每位參與者的累積心血管健康分數。

血液DNA甲基化分析：使用來自Illumina因美納公司的Infinium™ MethylationEPIC BeadChip檢測超過840,000個甲基化標記點。

全基因組關聯分析（EWAS）：通過多元線性回歸模型，調整年齡、性別、種族、學習中心、教育、技術批次因素和估計的血細胞類型比例等協變量，以確定與累積CVH評分相關的甲基化標記。

懲罰性回歸建模：使用懲罰性回歸建立基于甲基化的風險評分（MRS），評估冠狀動脈鈣化和臨床CVD事件的風險。

此實驗方法的特點如下：

覆蓋廣泛：EPIC陣列能夠覆蓋廣泛的基因組區域，提供大規模的甲基化數據分析。

重復性高：采用兩個時間點的甲基化數據提高了發現的可靠性。

調整多方面因素：通過調整多個協變量，降低混雜變量影響，提高了結果的穩健性。

縱向研究設計：可以評估時間相關的變化和長期風險。

交叉驗證：將CARDIA數據與FHS數據比較，提高研究發現的普遍性和可信度。

這個流程圖展示了整個研究的設計和執行步驟。其中包括在CARDIA研究中通過EPIC芯片得到甲基化數據，并進行全基因組關聯分析（EWAS）來鑒定與累計CVH顯著相關的甲基化標記。在FHS中，使用450K芯片的數據進行交叉驗證。此外，還進行了多種額外分析以提高CARDIA中心血管健康相關甲基化標記的穩健性，如按種族和性別分層分析、敏感性分析、前瞻性分析及CVH與甲基化變化分析。最后，研究人員對鑒定出的甲基化標記進行了基因注釋、調節標記富集和功能分析，并評估了這些標記預測冠狀動脈鈣化風險的潛在臨床應用。

表1 提供了CARDIA（Coronary Artery Risk Development in Young Adults, 年輕人冠狀動脈風險的發展研究）和FHS（Framingham Heart Study,弗萊明翰心臟研究）參與者的特性概覽。包含的主要信息是：有 CARDIA的平均年齡在Y15是40歲，在Y20是45歲。相比之下，FHS的Third Generation（第三代）隊列的平均年齡也是45歲，但年齡范圍更廣（24-71歲）。FHS的Offspring（子代）隊列的平均年齡是65歲，年齡范圍是更寬的40-90歲。以及其他人口統計信息，如性別、種族、教育水平、是否過量飲酒、吸煙狀態、既往疾病史、有關體育活動水平、BMI（體重指數）、血壓、膽固醇和血糖控制等，也包含在內。

圖2中，A和B是兩個圓形的曼哈頓圖，它們分別展示與年輕成年期到中年期不同時間點心血管健康（CVH）評分相關的DNA甲基化標記。在圖2A中，Y15是指在平均年齡40歲時的數據，圖2B中的Y20則代表在平均年齡45歲時的數據。外環顯示了與累積CVH評分最相關的甲基化標記，而隨著向內環移動，代表越早期的CVH測量時間點與甲基化評分的關聯。紅色的點表示不同時間點測量的CVH評分與甲基化水平之間存在顯著相關的標記。圖中的基因標簽表示距離甲基化標記最近的基因，顏色的漸變表示這些標記與基因轉錄起始點（TSS）的距離。通過此圖，我們可以看出甲基化標記與累積CVH之間的相關性如何隨時間而增強，同時還可以識別出與心血管健康變化關聯最緊密的基因。

圖3 提供了對比分析，檢驗心血管健康（CVH）相關的45個DNA甲基化位點之間的一致性。這個一致性是通過這些位點在不同研究中的相關性系數（β系數）表示的。

圖3A 展示了CARDIA研究中的兩個時間點（Y15比Y20）甲基化的β系數比較。點越靠近圖中的對角線，表示Y15與Y20測量的甲基化標記之間的一致性越高。圖中標出的偏離對角線的點表示Y20時測量甲基化標記的關聯性比Y15時更強。

圖3B 和 圖3C 分別比較了CARDIA研究中的甲基化標記與FHS研究的Offspring和Third Generation隊列中的甲基化標記之間的相關性。高度的一致性表示這些CVH相關的甲基化標記在跨越不同人群和時間點的研究中都有相似的表現。

圖3D 和 圖3E 使用盒圖展示了這些甲基化標記在CARDIA和FHS中每個時間點P值（-log10 轉換后）的水平，體現隨著時間的推移、隨著參與者年齡增長，關聯性的增強。

這些分析提供了我們研究發現的渡跨性證據，以及隨著年齡增長這些甲基化標記與CVH之間關聯性增強的動態圖景。

圖4 通過Ridge Plot（山脊圖或稱脊線圖）展示了基因富集分析的結果。圖中展示了根據基因本體論（GO）富集的最重要幾個GO術語的基因-甲基化關系。GO術語反映這些基因在細胞活動中的功能。水平的線展示了不同GO術語對應基因的甲基化標記β系數的分布情況。取正值的β表示在更好的CVH關聯下基因甲基化水平偏低（即假設此甲基化位點與基因表達為負相關時，基因被上調），而取負值則表示這些標記在更好的CVH關聯下基因甲基化水平偏高（基因被下調）。

這些分析揭示了在不同的生物學過程中，DNA甲基化狀態如何在良好心血管健康狀態下區分表現為高度甲基化或低度甲基化。例如，表現為高度甲基化的"細胞因子產生"和"白細胞分化"過程可能反映抑制功能，而"胰島素分泌"和"脂質代謝"過程中偏低的甲基化與這些功能的激活相關。

圖5A 顯示了三個甲基化位點在心血管健康和冠狀動脈鈣化（CAC）之間的潛在中介作用。這三個位點位于SARS1、LINC-PINT和SOCS3基因中，它們的甲基化水平統計上中介了15年累計CVH對CAC風險的20.4%的影響。方向性箭頭α和β表示了CVH與甲基化水平以及甲基化與CAC風險之間的相關系數，而中介的比例是通過這些系數的乘積計算得出的，即甲基化位點如何在CVH對CAC風險的總體影響中發揮了一定的作用。

圖5B 依據甲基化風險評分（MRS）將參與者分成三組，并展示了在不同CVH狀態下參與者發生CAC的風險。圖中可以看到在中等（5或6分）和差（少于等于4分）CVH分數的個體中，MRS得分高的組與CAC發生的風險顯著相關。而在保持理想CVH狀態的個體中，MRS沒有顯著的預測作用。

圖5C 通過比較接受者操作特征曲線（ROC），檢驗了在預測CAC風險時僅使用累計CVH評分與聯合使用CVH評分和MRS的效能。這種分析可以幫助評價MRS作為一個獨立工具在風險預測上的額外價值。ROC曲線下的面積（AUC）從0.71增加到0.77，說明添加MRS能提高對CAC狀態的預測準確性。

圖5 顯示了心血管健康（CVH）相關的甲基化標記在臨床應用方面的潛在價值，強調了將甲基化標記轉化為預測心血管疾病風險的工具的可行性，表明基于甲基化的指標能夠補充傳統的心血管健康評分并提供更精準的風險評估，這可能在臨床預防策略和早期干預中發揮重要作用。

表2 展示了在CARDIA開發的基于甲基化的風險評分（MRS）與緊隨其后在FHS中心血管事件發生風險的關聯。表中所示的每一分MRS增加，心血管事件的風險比例（hazard ratio, HR）表明MRS與未來心血管疾病事件的發生呈正相關，即MRS分數越高，發生心血管疾病的風險越大。此數據支持了將MRS作為一個可能有用的工具來評估心血管疾病風險。