作為強大的基因編輯工具，CRISPR及相關的Cas蛋白已經徹底改變了生物學研究，并有機會治療一系列遺傳疾病，讓生物醫學界大為振奮。然而，盡管CRISPR技術廣泛應用于研究領域，臨床試驗成功案例也層出不窮，但目前僅有一種CRISPR基因編輯療法獲批用于臨床。
2023年底，Vertex Pharmaceuticals和CRISPR Therapeutics合作開發的CRISPR基因編輯療法相繼獲得英國和美國相關部門的批準。這種Exa-cel療法在體外對患者的造血干細胞進行編輯，使血紅蛋白產生高水平的胎兒血紅蛋白，適用于鐮狀細胞性貧血和β地中海貧血患者1,2。
盡管CRISPR技術前景廣闊，但也面臨著巨大的挑戰和局限，必須克服這些才能在臨床環境中充分發揮其潛力。在這篇文章中，我們將深入探討CRISPR療法面臨的挑戰和局限，以及人們為利用CRISPR來治療人類疾病所做的努力。
CRISPR掀起的革命
與以往的基因編輯技術（比如ZFN和TALEN）不同，CRISPR基因編輯不依賴改造的蛋白，而是由向導RNA（sgRNA）將Cas內切酶帶到目標位點，并引入雙鏈斷裂（DSB）。之后，雙鏈斷裂會觸發內源性DNA修復途徑，比如非同源末端連接，這是一個容易出錯的過程，可在目標位點上引入插入缺失和移碼突變，從而實現高效的基因敲除?；蛘?，在外源性模板存在的情況下，雙鏈斷裂激活同源修復，產生所需的突變或序列插入。
CRISPR基因編輯的靈活性、高效性和準確性使其超越了ZFN和TALEN，成為目前主流的基因編輯工具3。然而，將其應用于臨床仍面臨著巨大的挑戰，例如脫靶效應、體內穩定性以及宿主產生免疫原性反應的可能性。在利用CRISPR來治療疾病時，首先需要解決這些難題。
最大程度減少脫靶效應
在將CRISPR基因編輯廣泛應用于臨床之前，需要克服的最大挑戰是降低脫靶效應的風險，也就是預期靶點以外的位點發生意想不到的遺傳改變4。研究人員通過開發更精確的Cas9變體和優化向導RNA設計，在提高CRISPR精確度方面已取得了重大進展。
然而，依賴雙鏈斷裂也會造成嚴重的安全問題，CRISPR基因編輯會導致細胞死亡，或造成大片段堿基缺失和染色體失序，從而有可能引發惡性腫瘤5。目前的研究重點是開發不引入雙鏈斷裂的CRISPR系統，比如堿基編輯、先導編輯以及TWIN-PE和PASTE等衍生系統，這些系統可在不引入雙鏈斷裂的情況下進行基因編輯，未來在基因治療方面擁有巨大潛力6。
遞送方面的挑戰
CRISPR療法面臨的另一主要障礙是如何高效安全地將編輯元件遞送到目標細胞和組織。對于許多遺傳疾病而言，包括Cas9和sgRNA在內的編輯元件需要遞送到體內的特定器官或組織。靶向內部器官或穿越血腦屏障，這的確是一大挑戰。
人們通常使用腺相關病毒（AAV）等病毒載體，但它們的包裝容量有限。慢病毒等載體具有較大的包裝能力，但會隨機整合到基因組中，如果插入癌基因中，則會造成問題。人們也在探索非病毒遞送方法，包括脂質納米載體、聚合物納米顆粒和外泌體，它們都具有良好的前景。
每種方法都有其優勢和局限，選擇哪種遞送方法取決于具體的治療應用。實現高效的靶向遞送，同時最大限度降低脫靶效應和免疫反應，目前仍然是一項挑戰。盡管如此，技術上的不斷開發和優化為未來的臨床成功帶來了希望。
降低免疫原性
免疫系統一直在兢兢業業地抵御著外來入侵者，當然也包括用于CRISPR遞送的病毒載體。1999年，18歲的Jesse Gelsinger因腺病毒誘發的炎癥反應而死亡，此后，基因療法的免疫原性被廣泛認知7。
當CRISPR組分被引入人體時，它們也會引發免疫反應，導致編輯細胞被破壞或使治療失效。為了緩解這一點，科學家們試圖開發出缺乏誘導反應外顯子的Cas9組分。在小鼠模型中，這些Cas9衍生物不會引起體液免疫和細胞免疫反應8。
減輕免疫反應風險的另一種方法是靶向免疫豁免器官，比如眼睛、大腦和睪丸9。在一項針對179名遺傳性視網膜疾病患者的研究中，科學家們發現76%的患者帶有致病等位基因，有可能成為CRISPR基因療法的候選靶點，這突出了CRISPR基因療法在這些區域的適用性10。
未來充滿希望
基于CRISPR的療法仍然需要克服許多重大挑戰，才能在遺傳病治療領域占領一席之地。不過，最近Vertex Pharmaceuticals的CRISPR療法獲得批準，讓人們看到了未來的希望。
研究界正在努力開發脫靶活性較低的CRISPR系統，優化CRISPR遞送，并降低與不良免疫反應相關的風險，這意味著未來幾年也許會出現更多的CRISPR基因編輯療法成功案例。CRISPR療法的前景依然光明，它為遺傳病患者帶來希望，并有望改變精準醫療的格局。
參考文獻
1. Sheridan, C. The world’s first CRISPR therapy is approved: who will receive it? Nat Biot News. (2023).
2. https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda-approves-first-gene-therapies-treat-patients-sickle-cell-disease
3. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nat Commun 9, 1911 (2018).
4. Li, T., Yang, Y., Qi, H. et al. CRISPR/Cas9 therapeutics: progress and prospects. Sig Transduct Target Ther 8, 36 (2023).
5. Zuccaro, M. V. et al. Allele-specific chromosome removal after Cas9 cleavage in human embryos. Cell 183, 1650–1664.e1615 (2020).
6. Tao, J., Bauer, D.E. & Chiarle, R. Assessing and advancing the safety of CRISPR-Cas tools: from DNA to RNA editing. Nat Commun 14, 212 (2023).
7. Sibbald B. Death but one unintended consequence of gene-therapy trial. CMAJ. 2001 May 29;164(11):1612.
8. Wang, D., Zhang, F. & Gao, G. CRISPR-based therapeutic genome editing: strategies and in vivo delivery by AAV vectors. Cell 181, 136–150 (2020).
9. Rasul, M.F., Hussen, B.M., Salihi, A. et al. Strategies to overcome the main challenges of the use of CRISPR/Cas9 as a replacement for cancer therapy. Mol Cancer 21, 64 (2022).
10. Fry LE, McClements ME, MacLaren RE. Analysis of Pathogenic Variants Correctable With CRISPR Base Editing Among Patients With Recessive Inherited Retinal Degeneration. JAMA Ophthalmol. 2021;139(3):319–328.
（文章來源：www.ebiotrade.com/newsf/2024-2）
| 
